酶联免疫吸附法在食品检验中的应用

　　摘要：酶联免疫吸附技术（ELISA）是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合的一种免疫分析方法，具有操作简便、快速、有效、特异性强等特点，能批量检测食品中的药物残留、病原微生物以及转基因食品等。本文主要阐述了酶联免疫吸附法在食品安全检测中的应用。 
　　食品安全问题是全球关注的焦点，它直接影响人类健康和经济发展，几年前的苏丹红事件、啤酒甲醛风波、人造蜂蜜事件、乃至今年的三鹿奶粉事件都给人们敲响了食品安全的警钟。如何快速、有效检测食品中的毒害残留，保证食品的安全供应是食品检验中的一个重点。酶联免疫吸附技术（ELISA）是在免疫荧光和放射免疫分析技术基础上形成的，将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合的一种免疫分析方法。该方法操作简便、快速、有效、特异性强，能广泛用于临床标本、药物残留、转基因食品以及病原微生物检测等多个领域。本文主要概述了酶联免疫吸附法在食品安全检测中的研究及应用前景。 
　　1、酶联免疫吸附法概述 
　　1.1 原理 
　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 
　　1.2分类 
　　目前ELISA检测方法的分类仍没有统一的定论，在这些测定方法中都有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA的主要类型包括双抗体夹心法、间接法、捕获包被法，以及竞争法。其中捕获包被法主要用于测定IgM类抗体；双抗体夹心法和间接法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断；而竞争法测定的是小分子抗原，适于食品分析[1]。 
　　2、酶联免疫吸附法在食品检测中的应用 
　　2.1食品中微生物的检测 
　　微生物检测是评价食品被污染程度的重要指标，一般来说微生物检测分为常规菌检测和致病菌检测。传统检测常规菌的方法是富集培养后计数，对于致病菌检测不仅需要分离培养，还需要进行生化反应鉴定，检测周期长且不易检出潜在的致病菌。比如某些细菌，大肠杆菌、霍乱弧菌等在低温贫营养条件下，可进入“活的非可培养状态”（VBNC），在适当条件下又可以复苏，仍具有致病力。姚斐等[2]用间接ELISA可快速有效检测出VBNC大肠杆菌O157：H7，此外，采用Dot-ELISA检测沙门氏菌，耗时短，比传统方法快4-6d，这都表明了ELISA在这方面有一定的潜力 
　　2.2食品中药物残留的检测 
　　食品中的药物残留主要包括农药、兽药的残留以及各种饲料添加剂的残留等，传统的检测方法有气象色谱、质谱以及高效液相色谱等，但这些方法检测痕量药物时成本高、对仪器要求也较高。而ELISA法检测操作简单、灵敏，可同时检测大批量样品，目前已有商业化的ELISA试剂盒可供选择，使得ELISA检测成为普通实验室的常规技术。余向阳等[3]以辣根过氧化物酶对兔抗拟除虫菊酯类农药抗体进行标记，建立了检测蔬菜中多种拟除虫菊酯类农药的直接竞争抑制ELISA方法，用该方法对南京市场107个样品检测的阳性检出率明显高于气相色谱法。Li[4]报道了用间接竞争ELISA法检测杀虫剂吡虫啉，其最低检出量为30ng/mL。岳秀英等[5]建立了酶联免疫吸附法检测牛奶中残留的青霉素，最低检出限为2.0μg/L，达到了国内外行业标准规定的要求。贺亮[6]研究了磺胺二甲嘧啶残留检测ELISA反应的各种条件并进行了筛选优化，建立了直接竞争ELISA检测方法，该法最小检出量为1.97ng/mL，检测范围5ng/mL～200ng/mL。现已开发的商业化酶联免疫ELISA检测试剂盒，可快速定性、定量检测动物组织（肌肉/肝脏/鱼/虾）、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清等样品中磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲恶唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）药物的残留量。 
　　三聚氰胺[C3N3（NH2）3]，俗称“蛋白精”，是一种有机化工原料，常温下为一种无毒无味的白色结晶粉末，添加到饲料中可以冒充蛋白质，少量添加即可大大提高蛋白含量。在饲料中添加三聚氰胺是属于违规行为。陈锡龙等[7]用市售的美国Beacon Analytical Systems Inc.公司开发的三聚氰胺定量检测试剂盒对检测动物饲料样品进行了初步的研究和探讨，结果表明，该试剂盒可以用来进行三聚氰胺检测的筛选，从而节约时间、减少工作量、降低检测成本。 
　　2.3食品中毒素的检测 
　　食品中天然存在的毒素、适合条件下产生的次生代谢毒素，以及在加工过程产生的毒素，如动物肝脏毒素、河豚毒素、真菌毒素、亚硝基胺等都会对引起食物中毒，甚至对人体造成畸形、癌变等危害，所以食品中毒素也日益受到关注。黄曲霉毒素是一种致毒性和致癌性很强的真菌毒素，各国都严格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最强。1977年，La Well首次采用了ELISA法来检测黄曲霉毒素。蒋建云等[8]利用ELISA法的AFB1试剂盒，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测黄曲霉毒素B1的含量。具有分析速度快，提取和纯化步骤简便，准确度高、成本低、污染少，一次可测定大批量等优点。Ying等[9]将化学发光反应作为终止反应引入直接竞争ELISA法中发展的ECL-ELISA体系，可检测黄曲霉毒素B1的范围是0.14-0.9μg/L，最低检出限为0.09μg/L，比使用相同抗体和辣根过氧氢酶结合物的常规ELISA检测的灵敏度高了10倍而时间减短了30%，这表明ECL-ELISA法能够用于食品中FB1的特异性检测和常规检测。 　　2.4转基因食品的检测 
　　转基因食品就是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质而创造的新产品。直到目前为止，对于转基因食品安全性评估仍没有共识，许多国家都有严格的法规来管理转基因食品。我国在1993年由国家科委颁布了“基因工程安全管理办法”，用于指导全国的基因工程研究和开发工作。2000年又由国家环保总局牵头，8个相关部门参与，共同制订了《中国国家生物安全框架》。转基因生物的检测技术大体可分为两种：一是从插入基因入手的PCR法，二是检测表达蛋白的ELISA法。美国FDA已研究出用双夹心ELISA法检测食品中是否含有转基因玉米成分，EnviroLogix ELISA试剂盒可用于测定玉米中的CrygC蛋白，在同一实验室和实验室间共测定了9种含玉米的食品，测定结果的重现性很好。顾炜炜、潘家荣[10]研制了用于检测转基因食品中Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白的直接竞争ELISA试剂盒，研究结果表明：该试剂盒的最低检测限为40ng/mL，线性检测范围为40～2000ng/mL，可满足实际生产中大批量样品的快速检测。 
　　2.5食品中其他成分的检测 
　　牛乳是日常生活中不可或缺的营养品，为人体提供了丰富的营养成分。牛乳特别是牛初乳中IgG的含量很高，其含量与其他生物活性物质的含量具有一定的正相关，测定IgG的含量足可以说明产品的优劣。常规方法无法检测IgG的含量和活性，酶联免疫吸附试验可以解决这个问题，Hurley等[11]用间接竞争ELISA法最低可检出1.0μg/mL的牛IgG或是0.1% （V/V） 的牛奶掺杂物。 
　　在肉制品中掺假不仅损害消费者的利益，还有可能引起某些人对某种肉的过敏反应，因此必须建立鉴别肉的组成的方法。ELISA方法快速、灵敏，并已在商业上得到应用，对生鲜肉通常是检测血清白蛋白，对热处理的肉制品则需检测对热稳定的肌肉抗原。陆朱发等[12]以辣根过氧化物酶标记兔抗不同动物肌肉和血清球蛋白抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉，检出率均在95%以上。与其他血清学方法相比具有较高的敏感性和特异性，判断指标客观真实。Rencova建立了间接竞争ELISA来检测经热处理的鸡肉、马肉、袋鼠肉和鼠肉，用该法对市购的62种肉制品进行检测，发现标明只含有牛肉或猪肉的产品中有4个含有鸡肉，鼠肉未检测到[13]。Y. AYAZ等[14]用酶联免疫分析试剂盒对100种肉制品进行分析，结果发现22%的抽样样本都存在不同程度的掺假现象。 
　　3、结语 
　　与传统的检测方法相比，ELISA分析法具有特异性高、灵敏度高、稳定性好、操作简单、可大批量检测样品、对仪器要求不高等特点，可降低检测的成本从而实现样品的现场检测。但是ELISA法也有一定的局限性：（1）制备抗体比较困难；（2）对试剂的选择性高，无法进行多残留检测；（3）分析低分子量或不稳定的化合物有一定的困难；（4）对结构类似的化合物存在一定程度的交叉反应；（5）易出现假阴性结果：一方面蛋白质在食品加工过程中易变性，已加工食品中的蛋白质很可能失去抗体所针对的抗原表位，从而造成ELISA检测结果假阴性。另一方面蛋白质在受体生物基因组内表达前后如进行新的修饰，也可导致检测敏感性降低及假阴性结果。 
　　随着科技的进步和研究的深入，不断开发重复性好的单克隆抗体和高免疫原性的重组抗原，增加ELISA检测的特异性、扩大检测的范围、提高检测的稳定性，加快ELISA的商业化进程。此外，将ELISA检测同其他检测技术（如PCR、HPLC、GC/MS）相结合，实现强强联合，增加检测的灵敏度、降低交叉反应，使ELISA检测更加准确的定量。在未来的食品安全检测中，ELISA检测将会发挥越来越重要的作用。