分子技术快速检测食品有害微生物

食品污染大多数是因为病原微生物引起的，传统的检验病原体的方法主要依靠具体的微生物学和生物化学免疫识别技术，比如培养基方法、分子生物学方法和免疫技术检测，这些方法都能定量定性分析病原体，但它们耗时、花费大，且需要专业的技术人员。而新的分子技术如生物传感器、微阵列、电子鼻子和纳米装置等能更快更准确地检测食品中的病原体。

器和免疫芯片等。

Ｂｏｕｒｅｔｔｅ等将Ｅ．ｃｏｌｉ抗体共价固定在经戊二醛活化的有孔氨丙基玻璃珠上，构成ＦＩＡ免疫传感器，用来检测食品中的Ｅ．ｃｏｌｉ，其检出限为５×１０７ＣＦＭ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ，检测时间不到３０　ｍｉｎ，可重复使用３００次以上［３］。司士辉报道的利用压电晶体免疫传感器，通过蛋白Ａ将肠道细菌共同抗原的单克隆抗体包被在石英晶体表面，检测晶体频率的变化即可以检测食物以及饮用水中许多肠道致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌等［１］。

免疫传感器已用于弗朗西斯氏菌、布鲁士菌、奈瑟氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌等的检测。１．２基因传感器

基因传感器就是把已知核苷酸序列的半单链ＤＮＡ分子固定在传感器上（也称ｓｓＤＮＡ探针），和另一条互补的ｓｓＤＮＡ（目标ＤＮＡ）杂交，形成双链ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）后会表现出一定的物理信号，再通过换能器反应出来。

目前基因传感器主要有电极电化学式基因传感器、石英晶体振荡器（ＱＣＭ）、质量式基因传感器、光寻址式基因传感器、场效应管式基因传感器、表面等离子谐振（ＳＰＲ）光学式ＤＮＡ传感器等［４］。

Ｕｒａｍａｔｓｕ等采用抗体压电晶体生物传感器测定大肠杆菌，检测细菌下限为１０５个／ｍｌ。利用花菁与染色标记的单克隆抗Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７设计了一种便携式光纤生物传感器，可检测Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７∶Ｈ７，检测范围３～３０ＣＦＵ／ｍｌ，具有高度专一性［２］。

基因传感器使对目的ＤＮＡ测量时间大大缩短，且操作简单、灵敏度高。

１生物传感器（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）

生物传感器是以生物化学和传感技术为基础，用酶、抗体、细胞等生物活性物质作为分子识别元件，配上信号转换器和电子测量仪所构成的分析工具。样品通过扩散作用进入分子识别元件，经分子识别，然后与分子识别元件发生特异性结合，其生物化学反应产生的生物学信息通过信号转换器转化为光信号或电信号，再通过仪表的放大和输出，即达到检测的目的。生物传感器具有准确、灵敏、易操作和可重复使用等优点。

根据生物分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、基因传感器、免疫传感器等。用于食品微生物检测的主要是免疫传感器、基因传感器［１，２］。１．１免疫传感器

免疫传感器是用抗原或抗体作为分子识别部分，光纤及荧光计等作为信号转换部分的生物传感器，主要有：酶免疫传感器、电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电晶体免疫传感器、表面等离子共振型免疫传感

作者简介：杜小琴（１９８２～　　），女，四川华蓥人，在读硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。

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中国食物与营养

２微阵列（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）

阵列是对事物的有序排列，根据样品点的大小，阵列可分为大阵列（ｍａｃｒｏａｒｒａｙ）和微阵列（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。大阵列的样品点直径大于３００μｍ，一般用胶膜扫描仪来显像检测；而微阵列的样品点直径小于２００μｍ，必须用特定的自动仪和显像设备来显像检测。由于微阵列的样品点很小，因而单个微阵列可容纳数千个甚至上万个样品，这样就大大提高了检测效率［５］。

目前微阵列有ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、蛋白质微阵列等，而ＤＮＡ微阵列用途最广泛。ＤＮＡ微阵列是将载物玻璃片和膜上作为探针ＤＮＡ的寡聚核苷酸及ｃＤＮＡ，使其与荧光标记了的靶ＤＮＡ相杂交，再扫描显像并测定杂交微阵列中各样品点的荧光高度，最后统计分析所得数据。根据探针ＤＮＡ的特性，ＤＮＡ微阵列可分为：ｃＤＮＡ微阵列和寡聚核苷酸微阵列（ＰＮＡ微阵列），ｃＤＮＡ微阵列是用ｃＤＮＡ为探针，而ＰＮＡ微阵列是以寡聚核苷酸为探针［５］。

ＤＮＡ微排列已用于快速检测病原细菌，如爱德华氏菌属、亚硝化单胞菌［６］、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０１５７∶Ｈ７、　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｓｐｐ．［７］等。

数据分析系统。３．１样品处理系统

样品处理系统是从样品中提取出不稳定化合物，是电子鼻子技术的关键。

样品处理技术有：静态顶部空间（ｓｔａｔｉｃ　ｈｅａｄｓｐａｃｅ，ＳＨＳ）、动态顶部空间（ｄｙｎａｍｉｃｈｅａｄｓｐａｃｅ，ＤＨＳ）、固相微提取（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＰＭＥ）、搅拌棒吸附提取（ｓｔｉｒ　ｂａｒ　ｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＢＳＥ）。具体选用哪种技术要考虑样品的类型。３．２检测系统

检测系统是电子鼻子的主要部分，有两种类型：固体气敏元件（ｓｏｌｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｇａｓ　ｓｅｎｓｏｒｓ）和质谱分析（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＳ）。

气敏元件电子鼻子基于不稳定化合物和固体气敏元件的物理、化学反应，这些传感器有广的选择性，高的敏感性、耐用性、稳定性，快的反应时间等优点。

质谱分析电子鼻子（ＭＳ）把不稳定化合物直接传入内含质谱分析装置的电离室，从同时进行的不稳定化合物破碎和电离过程中得到大量的光谱，每个碎离子都相当于一个传感器，这样质谱分析电子鼻子传感器的数量比气敏元件电子鼻子多，故质谱分析电子鼻子有多功能性，且稳定性和敏感性也高于气敏元件电子鼻子。３．３数据分析系统

数据分析系统就是分析气敏元件电子鼻子或质谱分析电子鼻子产生的信号［８］。

电子鼻子操作简单且反应快，目前已广泛用于食品检测。如电子鼻子Ｂｌｏｏｄｈｏｕｎｄ　ＢＨ－１１４能检测出食品中的枯草芽孢杆菌、青霉菌等［６］。

３电子鼻子（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　ｎｏｓｅ）

食品气味是由数百种有不同感官和化学性质的不稳定有机化合物组成的，这些有机化合物数量的微妙变化决定了产品的气味。并不是所有的不稳定化合物都有助于食品的气味产生，一个化合物是否有助于产生气味决定于它的浓度和感官极限（最小的浓度应被人的鼻子闻到）。浓度和感官极限的比率即为气味活性值（ｏｄｏｒ　ａｃ－ｔｉｖｉｔｙ　ｖａｌｕｅ，ＯＡＶ），当化合物的ＯＡＶ值大于１时，就有助于产生食品的气味。

很多产业评价食品气味还是主要靠人的鼻子，当我们闻气味时，先在鼻子里吸入不稳定化合物，不稳定化合物再和细胞膜上的受体蛋白反应，这一反应就会向大脑传输一个信号，从而大脑识别出气味对应的特殊分子。但人的鼻子鉴定需要专业训练人员，而且还受到人对气味反应的主观性和个体差异的影响。

电子鼻子实际上是一个电子嗅觉系统，它模仿人类鼻子接受器而制成的，有许多传感器。它的基本原理是样品中的不稳定化合物和大量气体传感器起反应，接下来，再分析鉴定样品的化学组成，达到检测的目的。 一个电子鼻子包括三部分：样品处理系统、检测系统、

４纳米装置（Ｎａｎｏ－ｄｅｖｉｃｅ）

纳米装置就是根据纳米粒子的特殊性质，把纳米粒子用于标记物的检测装置。

纳米（ｎａｎｏｍｅｔｅｒ，ｎｍ）是一个长度单位，当物体的尺度小到纳米尺度时，就会表现与宏观尺度物质不同的性能特点，称为纳米效应［９］。纳米效应如小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应导致它们可作为生物分析的标记物质，且能大大改善标记物的性能，显著提升灵敏度。用于生物分析的纳米粒子标记物按材料可分为金属纳米粒子、半导体纳米粒子、复合型纳米粒子［１０，１１］。４．１金属纳米粒子

金属纳米粒子有纳米金、纳米银等，最常见的是纳

杜小琴等：分子技术快速检测食品有害微生物４１

米金粒子，它具有良好的稳定性，由氯金酸氧化还原制成。纳米金对许多生物大分子都有很强的吸附作用，而且吸附后不会使生物分子变性，其颜色依直径大小而呈红色至紫色，根据这一性质把纳米金用于标记物，可以达到检测的目的。４．２半导体纳米粒子

半导体纳米粒子也称量子点或半导体纳米晶，它是由半导体材料制成的纳米晶体，尺寸在２～２０ｎｍ之间，常见的有ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＰｂＳ等，它是将半导体量子点与生物识别分子结合，用于成像或作为生物反应过程的标记。

４．３复合型纳米粒子

复合型纳米粒子是指用高分子材料包裹荧光分子或发光分子形成的纳米粒子。如包裹着若干个染料分子的荧光纳米球、包含着稀土螯合物的纳米粒子，这种包裹作用一方面能使更多的发光分子连接在生物分子上起到信号放大作用，另一方面可克服外界环境对发光试剂的影响，增加发光试剂的稳定性。

纳米粒子与待测ＤＮＡ偶联后，其纳米粒子标记物的检测方法主要有分光光度法、荧光分析法和电化学分析法。分光光度法是根据纳米粒子标记ＤＮＡ探针在分子杂交反应前后最大吸收波长的变化进行测定；荧光分析法是根据不同纳米粒子能被单一波长的光激发而发出不同颜色的不易降解的光，实现对纳米标记物的测定；电化学分析法是通过纳米粒子标记物中金属含量的测定，达到对纳米粒子标记物的测定。纳米装置能检测食品中大量的病原体，已用于检测大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７［６］。

还存在检测干扰物和生物分子稳定性等问题，需要进一步改进和完善。