影响酶免ELISA试剂盒操作的因素

一、酶免ELISA试剂盒特异性因素 

1、固相载体的选择.ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种,以微量滴定板最为常见.它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之间、同一板各孔之间性能相近.聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别,各产品的质量差异很大.因此,在选择试剂盒同时要对其使用的微孔板型号进行认证,评估。

2、包被物的纯度.在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中,试剂的特异性取决于使用抗原的纯度.目前由于技术条件的限制,包被用抗原或抗体的纯度不可能达到100%,所以有些非特异性显色不可避免,只能尽可能提高纯度,提高特异性.目前使用的包被抗原一般为合成多肽抗原. 

3、包被抗体的效价.具有高亲和力和高特异性的包被抗体,是决定试剂特异性的重要方面。

4、封闭.是ELISA中重要的一步,目的是封闭固相载体表面尚未被所占据的空隙,减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。

二、检验标本中含有酶标记物的干扰物 

1、内源性干扰物:类风湿因子（RF）、黄疸等,类风湿因子是可作用于多种动物以及人IgGFc段的自身抗体,多数为IgM类,能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应,从而呈现非特异性显色。

2、外源性干扰物,常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血,被细菌污染,标本凝集不全等.溶血标本,红细胞溶解破裂,释放出血红素形成,而血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色.如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP（辣根过氧化酶）,有国内报道酶免HBsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性。

三、操作过程中的问题造成假阳性 

1、加样 ：对于间接ELISA标本一般都要进行稀释,如果加样不准就会造成误差,尤其当稀释倍数大时,很小的绝对误差,会导致较大的相对误差,使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）.加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。

2、洗涤：在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步,应引起操作者重视.无论是手工操作还是机器操作,得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关,ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的.通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

3、温育 ：每种试剂都有其最佳反应模式,其中温度和温育时间控制是重要因素.因孵育温度高,反应时间长,会造成整板本底高,阳性率高.温育一般用湿盒或水浴,反应板不宜叠放,以保证各板温度都能迅速平衡,为避免蒸发,板上应加盖。

4、酶标仪判读 ：作为记录测定结果的仪器,酶标仪的性能稳定与否,决定结果的可靠度.首先酶标仪应定期进行保养,对滤光片要定期校正;其次酶标仪波长设置要正确,最好使用双波长,一个检测波长,一个参比波长,以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰.此外,在用酶标仪读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。

综上所述,由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化,尽管目前国际上以及我国有了部分标准血清或参比血清（血清盘）.但由于受方法学及技术条件的限制,在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性,但我们可以通过以上措施把非特异性显色降至最低限底,从而提高检测的特异性,并得到更准确、可靠的实验结果。