LSCM多重荧光标记

由于大部分实验都需同时观测两个或多个细胞内的组分，需要对细胞进行多重荧光标记。这时，研究者需要综合考虑实验目的、所使用的激光共聚焦显微镜配置和已有的实验材料。通常，激光共聚焦显微镜配备 4 个激光器(405nm 半导体固体激光器、氩离子激光器、543nm 氦/氖激光器或 561nm半导体固体激光器和633 nm 氦/氖激光器)。405nm 激光器可观察DAPI、Hoechst 和Alexa-405 系列的染料;氩离子激光器可观察 GFP 、CFP 和 YFP 等荧光蛋白，及Alexa-488 和 FITC 等染料;543 nm 和561 nm 激光器可观察 RFP 等荧光蛋白，及Alexa- 546、Alexa-561、Cy3、TRITC 和 Rhodamine 等染料;633nm 激光器可观察 Alexa-647 和 Cy5 等染料。当研究者需要使用上述染料进行多重标记时，要考虑各种抗体的来源，需要使用不同种属来源的抗体进行染色。例如，可使用如下的组合进行细胞标记:DAPI 标记细胞核、GFP 融合蛋白标记目的蛋白、Alexa-561标记抗鼠源抗体和 Alexa-633 标记抗兔源抗体。此外除了使用抗体标记细胞外，还可以使用荧光染料标记的化合物标记细胞内的一些细胞结构和细胞器，如 Phalloidin 标记 F-actin;ER-tracker 标记内质网;Mito-tracker 标记线粒体;Lyso-tracker 标记溶酶体等，这些荧光染料染色同抗体一起组合使用，可使得多重标记变得更容易。