如何平衡荧光蛋白的发射强度

显示了上面讨论的几个常见问题，多标样品（注意：图 6 中所有荧光团都只显示绿色和红色两种伪彩）经常会妨碍共定位的准确分析。用增强黄色荧光蛋白融合过氧化酶转染人类女性骨肉瘤上皮细胞，目标对象是缩氨酸序列（发绿色荧光），随后用免疫荧光的方法，用二次抗体标记 Alexa Fluor568(发红光)，目标对象是过氧化酶膜蛋白（ PMP-70），显示在图 6（ a）和图 6（ d）中。图 6（ a）中的背景太黑，致使标记的黄色荧光蛋白强度降低。这种错误使共定位分析发生偏移，对绿色通道中重叠的像素人为产生了较低的检测量。合适的图显示在图 6（ d），显示了明显较高的共定位程度。

猕猴肾上皮细胞的线粒体网络用 EYFP 和 HcRed1 荧光蛋白（此蛋白含有缩氨酸序列，目标对象是线粒体）转染。成像过程中，非常亮的 EYFP 大大地遮盖了HcRed1 发射的荧光信号，当检测通道的电压、增益和补偿值接近时， HcRed1 发射的荧光信号比 EYFP 要弱几乎 100 倍（图 6（ b））。调整 HcRed1 通道 PMT 的值可平衡荧光蛋白的发射强度以克服这种差异，共定位程度明显增加（图 6（ e））。图 6（ c）显示几个叠加通道重合不好，图中显示的是塔尔羊卵巢细胞，用 AlexaFluor488 耦合鬼笔环肽染色（目标对象是绿色丝状肌动蛋白），用 Alexa Fluor568二次抗体染色，目标对象是粘着斑蛋白抗体（粘着斑）。肌动蛋白丝末端应该与样品中粘着蛋白共定位，但在图 6（ c）中，他们没重合好，正如在图像右下角用红色和绿色荧光团标记的微球重合不好一样。采集完图像后，进行图像处理可将通道对齐，恢复图像的位置（也就是球的位置），为共定位分析提供了很好的样本。