纳米颗粒跟踪分析技术为外泌体表征开拓新途径

       外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌，大小较为均一，直径为30~100纳米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。随着分子技术的不断发展，生物学界对外泌体的探索日趋深入。2013年，三位国外科学家因在细胞膜转运机制的研究上取得关键性突破，被授予诺贝尔生理学或医学奖。由此，外泌体的研究达到了一个全新的高度。而近年来，越来越多的证据显示出外泌体对临床治疗的重要价值。外泌体是细胞间信使，通过其数量和生物化学组成的变化，可为进一步的临床诊断提供有力的证据。它携带多种蛋白质和miRNA，参与细胞信号转导、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程，并且有可能成为药物的天然载体，应用于肿瘤检测或临床治疗。

    但目前国内在外泌体研究方面的经验十分有限，无论是离心法、过滤离心还是免疫磁珠法，都无法同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。这首先就制约了外泌体样本的制取，进而对后续的表征造成困难。而测量技术的局限性也极大地阻碍了外泌体在这些领域的研究进展。

    在当前中国市场主流的外泌体表征方法中，研究人员的选择一般有电子显微镜、流式细胞仪和动态光散射技术。但电子显微镜一次只能观测数量有限的颗粒，在代表性上存在严重不足，同时，由于电子显微镜的样本制备过程比较复杂，因此很容易造成样本的形态、状态发生改变；流式细胞仪目前公认的测量颗粒粒径下限为300nm左右，大大超过了外泌体的粒径上限；而动态光散射技术不适合多分散的复杂外泌体样本的测量，且无法得出样品中外泌体的浓度。

    作为全球材料和生物物理表征领域的领先企业，马尔文为全球众多客户提供高性能的粒度表征解决方案，在业界享有盛誉。特别是其采用了全新一代纳米颗粒跟踪分析技术（马尔文ZL技术，以下简称NTA）的NanoSight产品系列，可以直接并实时观测纳米颗粒，通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄其在溶液中做布朗运动的影像，再对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。

      出色的质控作用

    外泌体的提取一直以来都是横亘在所有相关研究者面前的一道难题。生物细胞中的囊泡种类繁多，怎样证明提取的颗粒一定就是外泌体呢？电子显微镜在鉴定一定数量的颗粒属性方面固然有效，但如前所述，电子显微镜不适合对大量颗粒进行快速分析，而动态光散射技术又只能对分布相对均一的样本颗粒进行检测，并且不具备荧光功能。

    配备了先进NTA检测技术的马尔文NS 300在这时便体现出强大的功能：它能够进行严格的质控，通过对观察到的所有颗粒进行分析和计算，第一时间给出样本粒度的详细分布和浓度的具体信息。同时，研究人员还可以利用荧光标定重点的特定外泌体颗粒，从四种不同波长——405nm、 488nm、 532nm和635nm——的激光器中选择一款，搭配相应的滤光片，从而实现对荧光样品的测量，再由NTA技术对其进行单独检测，免受复杂样本（如血清、尿液等）环境的影响。对复杂样品的分辨能力对于像外泌体这样的研究对象来说至关重要。

    尤为关键的是，由于NTA的工作原理是通过将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品（悬浮颗粒的溶液）进行照射，配以玻璃表面镀铬使背景信号最小化，可让研究人员通过显微镜直接观察到纳米颗粒在溶液中的布朗运动，并拍摄影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，快速准确地计算出样本中纳米颗粒的流体力学半径和浓度。相对于其他传统技术，NTA能对悬浮液中粒径范围为10nm-2000nm的颗粒进行全方位表征，并且兼具极高的分辨率，对于粒度较为接近的颗粒仍然可以准确分析，特别适用于外泌体、蛋白质聚集、药物传输、纳米颗粒毒理、病毒和疫苗等复杂体系的相关研究。

    另外，马尔文NanoSight还可以测定颗粒的数量，准确指示样本溶液中的单位体积颗粒浓度和颗粒数量，进行以量为基准的粒径测试和分布测试。对于客户可能存在的样本量不足的研究情况，马尔文NS 300也能通过支持低浓度测试（最低可达到300微升）帮助实现既定监测目标；而同样的条件，传统电子显微镜很难实现有效的统计学分析。

   操作简便、工作效率高

    通常，大型仪器（如流式细胞仪）在使用前都需要进行复杂的预热和校准准备。马尔文NS 300则无需这样做，它只要连上电源就能直接使用。并且由于NTA技术采用的是斯托克斯-爱因斯坦方程的计算，所提供的是一个无关质量、折光度和颗粒材料的流体力学直径，因此仪器可跳过繁琐的校准直接进入研究分析，为工作人员节省研究前的时间。

    作为一种集成程度和自动化程度都非常高的仪器，马尔文NS 300除了将软硬件设备、摄像头和显微镜等集于一体，还整合了颗粒检测功能与纳米颗粒分析技术，为纳米颗粒表征提供易于使用的可重复平台。40cm x 25cm的设备主机集成了超高灵敏度科研级sCMOS光电传感器、温控单元和一个具有四种可选波长的激光。样品池和激光模块也能轻易的拆卸和组装，便于移动、清洁，适合高通量检测。强大的软件分析能力让马尔文NS 300在极短的时间内就能绘制出粒径—对应数量分布强度—颗粒散射光强的三维图谱，并得出与各种粒径颗粒有关的全面信息。这样不仅减少了人为操作失误的概率，更大大提高了研究人员的工作效率。

 总结与展望

      虽然外泌体作为生物标志物的研究在国内尚处于起步阶段，但它在临床治疗领域已显现出巨大的发展潜力。在临床诊断中，简单快速地在复杂生物背景下测量外泌体浓度、粒径是必备要求，目前存在的方法都无法完美地解决这一问题。NTA作为一项全新的测量技术，具有实时观测和荧光测量功能，能够以较高的分辨率，准确地测量颗粒浓度，从而为外泌体大小和浓度研究提供新的思路。而随着越来越多科研机构与研究项目成果的进一步披露，以马尔文NanoSight为代表的新一代NTA技术将会为推进外泌体研究乃至人类健康事业的发展做出更大贡献。