MALDITOFMS在病原微生物鉴定中的研究进展

       基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题。2002 年，诺贝尔化学奖获得者美国科学家约翰·芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特·维特里希发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法。芬恩和田中开发出了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法”，维特里希则开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。这些研究成果已成为检测和鉴定多肽、蛋白质的强有力工具，被广泛应用于生物技术和制药企业的药物开发、化学物质和生物病原体的监测等。MALDITOF-MS 具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。

       在MALDI-TOF-MS 的多种应用中，基于细菌表面蛋白分子量检测的MALDI-TOF-MS 技术是一种全新的微生物快速检测和鉴定技术。通过测定细菌自身独特的蛋白质组成，应用质谱技术将测得的蛋白质和多肽按分子量大小排列，形成独特的蛋白质组指纹图，通过特征性的模式峰进行菌株的鉴定。其基本原理为：将微生物与等量的基质分别点在加样板上，溶剂挥发后形成样品和基质的共晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，经过飞行时间检测器，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来检测离子的分子量，通过专用软件分析比较，确定出特异性的指纹图谱。图1 为MALDI-TOF MS的基本原理示意图。

       该技术不是基于微生物的生理生化指标和基因，而是根据各种微生物的蛋白质组表达谱的比较来进行的。每种微生物都有其区别于其他种类的独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱，这是由物种的遗传特性所决定的，受外界环境条件等影响较小。因此，相对于其他常用的微生物检验技术，蛋白质组指纹图谱更为准确和直接。目前，国内外学者已经在多种细菌的检测和鉴定方面取得良好的效果。MALDI-TOF-MS 具有灵敏、准确和快速的特点，适合各种微生物进行高通量的快速检测，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段。传统细菌鉴定方法基于形态学、革兰氏染色和生理生化特性分析，虽然结果准确、可靠，但一般需要数天时间才能完成，而且许多细菌鉴定程序十分繁琐。近年来发展起来的PCR、荧光PCR 和核酸序列分析等分子生物学检测技术在微生物鉴定方面虽然得到了一定的应用，但由于其敏感性高，容易出现假阳性，而且对近似种的细菌鉴定还存在一些不足。因此，对一些与人类健康关系密切的病原菌还需建立更加快速、准确、实用的检测和鉴定方法。

1 MALDI-TOF-MS 技术在普通病原菌鉴定方面的应用

       在常见的人和动物病原菌检测鉴定方面，MALDI-TOF-MS 技术已经在单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella sp.）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）及阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）等病原菌的快速鉴定方面进行应用，取得很好的结果。Veen 等对来自病人、并经传统生化技术鉴定的327 个分离株进行MALDI-TOF-MS 测试，差异结果用16S 基因进行分析。该方法可以在基因水平正确鉴别95.1% 的菌株，在种的水平正确鉴别率为85.6% ；对980 株来自临床的细菌和酵母菌株进行确认，总体上MALDI-TOF-MS 鉴定种的准确率明显好于传统的生化鉴定系统（分别为92.2% 和83.1%），错误率明显较少（分别为0.1% 和1.6%）。MALDITOF-MS 对肠杆菌科、非发酵的革兰氏阴性菌、葡萄球菌、混杂菌群和酵母菌的鉴定准确率分别达到97.7%、92%、84.8%、84% 和85.2%。试验结果表明，MALDI-TOF-MS 在葡萄球菌的鉴定以及属于混杂菌群的细菌种属的鉴定方面明显好于传统的方法。

       在法国，对来自医院的1013 个临床样品应用MALDI-TOF-MS 和传统的表型细菌生物学方法进行鉴定，差异结果用16S rRNA和 / 或 rpoB 基因测序进行确认。当样品未经纯培养时，MALDI-TOF-MS 可以对其中的837 个样品在种的水平进行正确鉴定；当样品经过纯培养后，可正确鉴定986 个样品。相对的，表型方法只能鉴别945 个样品。事实上，只有15% 的菌株必须先进行纯培养。在属的水平该结果更好，MALDI-TOF-MS 鉴别准确率可达99%，表型方法可达98%。对血液肉汤培养的细菌直接用MALDI-TOF-MS 进行鉴定，总共检测了212 个菌株，分属于32 属60 种或群，并与生化试验方法进行比较，差异用基因测序进行确认。162 株得到准确鉴定，42 株没有结果，主要因为血液肉汤培养基中的细菌数量不足。另外，8 株链球菌（Streptococcus mitis）被误诊为肺炎链球菌。

       单增李斯特菌是导致人类李斯特菌病的一种食源性病原，也为孕妇的条件致病菌。对李斯特菌属进行快速、准确的鉴定对及时干预和有效治疗十分重要。国外学者应用MALDI-TOF-MS 测试了不同的李斯特菌和血清型，包括临床分离株，不同李斯特菌的质谱图具有特征性的峰值。该方法与脉冲场凝胶电泳方法测试的不同血清型的李斯特菌进行比较表明，MALDI-TOF-MS 可以有效鉴别李斯特菌及其亚型，甚至可以在种水平鉴定到单增李斯特菌的致病株。我国学者也报道了利用MALDI-TOF-MS鉴定单增李斯特菌的方法获得很好的结果。

       脆弱拟杆菌及其相关的种是导致人类混合感染的重要病原，其不同的分离株表型较相似，生长速度较好氧菌慢得多，因此用传统方法或自动表型鉴定方法常常出现误诊。应用MALDI-TOF-MS 对277个临床细菌样品中的脆弱拟杆菌进行鉴定，同时用传统表型鉴定方法作为参考，对出现差异的以及MALDI-TOF-MS 不能鉴定的菌株采用16S rRNA 基因测序进行确认。结果其中的270 个样品与MALDI Biotyper 数据库中的参考菌株匹配分值大于2.0 ；23个与传统表型方法结果不同的样品中，11 个进行了测序。其中10 个样品序列证实MALDI-TOF-MS 结果准确，剩下的菌株序列无法鉴定到种，只能到属。表明MALDI-TOF-MS 比生化测试方法具有更高的鉴定能力和准确性。

       酵母和酵母样真菌对人类的严重感染导致的临床影响在不断增加，尤其是免疫抑制病人。因此，对病原进行快速和可靠的鉴定对抗真菌治疗十分重要。用MALDI-TOF-MS 对临床分离的267 株酵母菌进行快速鉴定，包括Candida、Cryptococcus、Saccharomyces、Trichosporon、Geotrichum、Pichia 和Blastoschizomyces spp.。结果与传统生化方法进行对照，MALDI-TOF-MS 方法对247 个临床分离株可以鉴定出准确结果，未发现假阳性；而传统的API生化鉴定方法在首轮只鉴定出244 个分离株。MALDI-TOF-MS 被证明是最快速和可靠的酵母和酵母样真菌鉴定方法。

       奈瑟菌属（Neisseria）包括对人类致病的脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌（N. gonorrhoeae）以及几种非致病的种类。Elena 等应用MALDI-TOF-MS鉴定奈瑟菌属的细菌，通过采集脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌以及其他非致病的奈瑟菌的试验和临床菌株的蛋白质谱，发现存在明显的种间差异，而种内差异很小。群聚分析可以成功地区分脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌和非致病奈瑟菌。

       奶粉中的阪崎肠杆菌（也称克罗诺杆菌）污染对幼儿具有严重的危害。我国赵贵明等应用MALDI-TOF-MS 与API 方法分别对32 株阪崎肠杆菌（28 株分离株，4 株参考菌株）与相近菌株阴沟肠杆菌、产气肠杆菌进行鉴定，并对鉴定结果分析比较。MALDI-TOF-MS 方法将32 株阪崎肠杆菌鉴定到种、属水平分别为56.2% 和37.5%，API 方法为75%、21.9%。3 株菌未获得鉴定结果，其余29 株菌的鉴定结果相符。通过对获得的菌株蛋白质质量图谱进行对比和聚类分析，可以将阪崎肠杆菌属进一步划分为不同类型，结果显示4 株阪崎肠杆菌参考菌株质量图谱约在5 740（m/z）离子质荷比处出现1个相近离子峰，28 株阪崎肠杆菌分离株中27 株（占96.4%）表现出相同结果。32 株阪崎肠杆菌被分为6种类型。因此，MALDI-TOF-MS 适合用于阪崎肠杆菌的鉴定，而且根据获得的细菌蛋白质图谱可将阪崎肠杆菌划分为不同类型。杨捷琳等从婴幼儿奶粉中分离得的阪崎肠杆菌，利用MALDI-TOF-MS测定得到了肽质量指纹图谱，最终鉴定出阪崎肠杆菌中特异性蛋白，为进一步开展阪崎肠杆菌的毒力及致病性的研究打下基础。

       梭菌属细菌因不容易培养，鉴别和分类都比较困难。基于细菌的代谢特点的传统方法需要严格的标准化的培养基和生长条件才能保证结果重现。虽然基于DNA 检测的方法，如针对种特异性基因的PCR 方法，可以得到准确、可重复的结果，但事实上其有效性十分有限，因为在传染病病例中毒素编码基因并非必需。16S rDNA 测序技术被认为是梭菌分类的金标准，可以鉴定难以培养的细菌，但也是一项耗时且昂贵的技术。应用MALDI-TOF-MS 技术对31 种64 株梭菌进行鉴定，在数分种内即可准确鉴定为梭菌。一些传统方法难以鉴别的梭菌如C.chauvoei 和C. septicum， 也能得到鉴定。因此，基于高质量参考数据库的MALDI-TOF-MS 技术可以作为快速、准确鉴定梭菌的有效工具。

       此外，国外还有许多学者应用MALDI-TOF-MS技术对大肠埃希氏菌及大肠杆菌0157:H7、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）等细菌进行鉴定，都取得良好的鉴定效果。

       MALDI-TOF-MS 技术以细菌表面蛋白为检测对象，因细菌蛋白主要取决于细菌自身的遗传因素，受培养基、培养时间以及其他培养条件等外部因素的影响较小，因而具有很好的稳定性和可重复性。其鉴定结果的准确性主要取决于数据库中采用的参考菌株的蛋白指纹图谱的准确性。因此，数据库中的参考菌株种类和数量越多，采集的蛋白指纹图谱越完善，得到的鉴定结果也越准确。应用MALDITOF-MS 出现的错误鉴别主要与其数据库中缺乏来自合适参考菌株的充分的质谱图有关。目前，传统生化鉴定方法容易受细菌活力和浓度等因素的影响，所有样品都需要先进行培养、单个菌落分离、再纯化培养得到充分纯化的菌株才可能鉴定出准确结果。而MALDI-TOF-MS 技术可以对一些医院的临床样品中的致病菌培养后未经纯化直接进行检测和鉴定，大大节省了时间，可以及时对病人采取有效的治疗措施。因此，应用MALDI-TOF-MS 技术研究和建立一些特殊病原菌的直接检测方法，对许多医院和微生物实验室具有良好的发展前景。

2 MALDI-TOF-MS 技术在多血清型细菌鉴定领域的应用

       细菌不仅种类多，而且同一种细菌常常还有多种血清型，而不同血清型的细菌，其生理生化特性可能存在明显的差异，尤其在对人类和动物的致病性方面可能完全不同。因此，如何对同一种细菌进行快速分型，是细菌鉴定的另一项重要课题。传统的细菌培养和生化鉴定方法无法对沙门氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌等多种与人类健康密切相关的多血清型病原菌进行分类，需要进一步采用血清学或噬菌体试验等技术。目前，应用MALDI-TOF-MS 技术对这些多血清型细菌进行鉴定和分类得到了初步应用，在沙门氏菌分型中表现出较好的分型能力。

       沙门氏菌是严重危害动物和人类健康的传染病病原。利用优化的MALDI-TOF-MS 试验条件对来自病人粪便的88 株沙门氏菌进行检测和分型，并与血清学分型、耐药分型和PFGE 分型结果进行比较。在反映亲缘关系的差异水平值为100 时，88 株沙门氏菌被分为15 个MALDI-TOF-MS 型别。MALDITOF-MS 分型结合耐药表型分型，可以将88 株沙门菌分成44 个亚型；MALDI-TOF-MS 分型结合血清学分型，可以将88 株菌分成46 个亚型。MALDI-TOFMS分型结合PFGE 分型，可以将88 株菌分成64 个亚型。对辽宁省食源性疾病监测检出的24 株沙门氏菌和2 株沙门氏菌标准菌株进行鉴定，并对其中4 种血清型的16 株沙门氏菌进行种水平的鉴定。结果分别在属和种的水平上准确鉴定了沙门菌株，并且在种的鉴定水平上与血清分型结果具有极大相关性。可以区分属于4 个种的4 株沙门氏菌的蛋白峰之间的微小差异。而且，对相同血清型的4 株肠炎沙门菌的聚类分析及主成分分析显示出其同源程度的差异。因此，MALDI-TOF-MS 技术在沙门氏菌血清分型中表现出较好的分型能力，在属水平上鉴定沙门氏菌具有很高的准确性，在种水平上的鉴定也有着很好的应用前景。

       虽然MALDI-TOF-MS 在沙门氏菌的血清分型中具有一定的分型能力，但其分型结果与传统的血清分型结果还存在明显的差异，可能因为MALDI-TOFMS主要依据细菌蛋白质组进行分类，而细菌的血清型并不完全取决于其蛋白组成。我们应用MALDITOF-MS 技术对不同血清型的霍乱弧菌、沙门氏菌和大肠杆菌进行检测和分型也出现一些不理想的结果；一些同种、不同血清型的细菌的蛋白质谱图十分相似，很难区分。目前，国内外在这方面的研究报告还很少，尚无法判定MALDI-TOF-MS 真正的血清分型能力。

3 MALDI-TOF-MS 技术在非发酵性细菌鉴定方面的应用

       发酵性细菌是指不能利用葡萄糖或仅能以氧化形式利用葡萄糖、专性需氧和无芽胞的革兰氏阴性杆菌，主要包括假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属和产碱菌属等，其中很多种类对人类为机会致病菌。近年来这一类类细菌从住院病人的痰、尿、血液和体液标本中的分离率日渐增高，其中假单胞菌属的铜绿假单胞菌在肺部感染中十分重要，已成为引起院内感染的重要致病菌。非发酵性细菌在自然环境中大量存在，但因其有限的生化反应特性和不同的形态特征，传统表型鉴定方法常常出现误诊。MALDI-TOF-MS 技术在鉴定非发酵性细菌方面已经表现出一定的优越性。

       Mellmann 采用MALDI-TOF-MS 检测了37属248 株非发酵的菌株，其中大部分与人体感染有关。按照仪器厂商的建议建立了基于MALDI-TOFMS的参考数据库。为评估该数据库，分析了80 株非发酵的临床盲样菌株。作为物种鉴定的参考方法，采用16S rRNA 部分序列测序的方法。通过16SrRNA 基因测序，80 菌株中的57 株具有可鉴别的特异的序列（ 同源性>99%）；11 株开始没有明确的结果，只能鉴定到属；10 株鉴定到属（同源性>97%）；2 株同源性低于极限值被认为无法鉴定，从进一步分析名单中排除。MALDI-TOF-MS 鉴定了78株菌中的67 株（ 85.9%），与参考方法相一致。9 株鉴定错误，2 株无法鉴定。当使用3 种不同的质谱图和4 种不同的培养基，10 株随机选择的菌株结果完全一致。因此，MALDI-TOF-MS 方法是一种准确、