组蛋白（Histone）在真核生物染色体中扮演着重要的角色，是染色体结构单元核小体的重要组成部分。由核心组蛋白H3，H4，H2A，H2B形成的八聚体是DNA缠绕的主要承载体【1】。除了用以装配染色体外，组蛋白的另外一个重要功能是参与基因组信息的表达调控。组蛋白氨基酸残基上的翻译后修饰如乙酰化、甲基化等调控着基因组特定区域的基因表达状况，最终使得含有相同DNA序列的细胞具有不同的命运【2–4】。
为了研究组蛋白修饰在真核生物中的功能，戴俊彪研究员早在2008年报道了组蛋白系统突变库的研究策略，通过将酵母基因组中组蛋白基因敲除并回补组蛋白突变体的方式，系统地研究了组蛋白H3和H4上每一个氨基酸位点被突变成丙氨酸之后对酵母造成的影响【5】，最近又完成了对组蛋白H2A和H2B的系统性突变研究【6,7】。然而酵母是单细胞真核生物，对于研究组蛋白在生物体发育过程中的功能存在先天局限。绝大部分多细胞真核生物由于组蛋白基因分散，基因打靶难度大等限制因素，至今尚无系统突变库研究报道。
2018年12月27日，上海科技大学高冠军课题组和中科院深圳先进技术研究院戴俊彪课题组合作在Developmental Cell在线发表了题为Probing the Function of Metazoan Histones with a Systematic Library of H3 and H4 Mutants的研究论文，研究者首先建立了果蝇组蛋白H3/H4系统突变库，并利用系统突变库解析了组蛋白剂量以及修饰在果蝇发育过程中的多重功能。
为了实现果蝇中野生型核心组蛋白基因的全敲除，研究人员利用CRISPR/Cas9技术分别在组蛋白基因列阵上下游各插入FRT（flippase recognition target）位点，利用重组酶flippase的作用实现基因组大片段删除，从而获得一条染色体上组蛋白基因全部删除的突变体，再通过杂交的方式可以获得组蛋白基因全敲除突变体。然而由于组蛋白对于胚胎的发育不可或缺，组蛋白基因全敲除突变体仅能够依靠母源组蛋白和组蛋白mRNA完成胚胎发育的前14个细胞周期【8】。研究人员进而在组蛋白敲除杂合突变体中利用phiC31整合酶系统在组蛋白基因列阵原位上回补了人工设计后的野生型组蛋白基因单元。研究人员发现，低剂量的组蛋白基因单元分别对果蝇精巢和卵巢造成不同程度的影响，而最终回补20个拷贝的组蛋白基因单元可以获得与野生型果蝇相类似的表型（图1）。
图1. 组蛋白基因剂量不足影响果蝇精巢和卵巢的发育
为了研究组蛋白修饰的功能，研究人员对组蛋白H3和H4上已报道被修饰的氨基酸位点逐一进行了丙氨酸的突变，利用独立开发的大片段重复序列分级组装策略，系统性构建了40个含有不同组蛋白突变的果蝇突变体模型（图2）。
图2. 组蛋白突变体分级组装策略示意图
研究者对这些果蝇突变体研究发现，接近50%的突变体无法发育成成体，表现出与单细胞酵母间巨大的差异性。通过基于平衡染色体上的荧光追踪，研究者将这些致死突变体根据致死时期分别划分为胚胎期、幼虫期以及蛹期致死突变体。随后研究者从果蝇育性、DNA损伤敏感性以及基因沉默等多方面入手，对突变库进行高通量测试，发现利用该H3/H4组蛋白突变库进行不同生物学问题的研究时，不仅可以得到与前人研究一致的研究结论，还能突破现有的研究局限，获得更深层次的认知。研究者以H4K16A突变体为例，发现乙酰转移酶MOF（males-absent on the first）对于雌性果蝇存活率以及寿命的调控并非通过H4K16位点乙酰化实现的，通过对卵巢中生殖干细胞数量的追踪发现，H4K16位点的修饰对于雌性果蝇生殖干细胞的维持是必需的。研究者还发现雄性H4K16A突变体存活率仅有10%左右，推测原因是在雄性H4K16A突变体中更多的X染色体连锁基因以及常染色体基因表达发生了下调。
由于胚胎期致死组蛋白突变体无法获取实验材料，例如纯合H3K27A胚胎在发育10小时左右停止细胞分裂（图3A），极大地限制了对这一类突变体的研究。为此，研究者单独开发了一套组织条件性敲除系统，能够在既含有野生型也含有突变型组蛋白基因的成体果蝇中，简单快速地敲除一部分体细胞中的野生型组蛋白基因，从而在成体果蝇中研究某一特定组蛋白突变对基因表达调控的影响。以多梳（Polycomb）蛋白调控为例，研究者利用组织条件性敲除系统，鉴定到H3R26A突变体通过影响H3K27三甲基化实现对Hox基因解抑制作用。
图3. H3R26A突变体通过影响H3K27me3实现对Hox基因解抑制作用
该研究利用CRISPR/Cas9系统对果蝇组蛋白基因列阵进行全敲除编辑，首次实现在基因组中组蛋白原位进行回补，排除了基因位置效应影响，并且在构建组蛋白突变体通量上实现巨大突破，为国际同行提供了新颖的研究思路和宝贵的研究资源。
1.Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature 389, 251–260 (1997).
2.Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell 128, 693–705 (2007).
3.Tan, M. et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell 146, 1016–1028 (2011).
4.Goldberg, A. D., Allis, C. D. & Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell 128, 635–638 (2007).
5.Dai, J. et al. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile Library of Synthetic Histone H3 and H4 Mutants. Cell 134, 1066–1078 (2008).
6. Jiang, S. et al. Dissecting Nucleosome Function with a Comprehensive Histone H2A and H2B Mutant Library. G3 (Bethesda) 7:3857-3866 (2017).
7. Jiang, S. et al. Construction of Comprehensive Dosage-Matching Core Histone Mutant Libraries for Saccharomyces cerevisiae. Genetics 207:1263-1273 (2017).
8.Günesdogan, U., Jäckle, H. & Herzig, A. Histone supply regulates S phase timing and cell cycle progression. Elife 3, e02443 (2014).