免疫PCR技术（ImmunoPCR）

免疫PCR技术（Immuno-PCR）

 免疫PCR方法（Immuno-PCR）是Takeshi等1992年将免疫学反应和PCR技术相结合而创建的一种新的检测技术，具有抗原、抗体反应的特异性和PCR技术的高效性。它运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到1至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。
免疫PCR主要由两个部分组成：*部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应；第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。其基本过程如下:首先将待检测的抗原吸附于固相，经封闭和冲洗后加入特异的抗体，此抗体常采用生物素标记。经孵育和冲洗后加入作为连接分子的亲和素或叶绿素，再孵育和冲洗加生物素标记的DNA，孵育和冲洗去除游离的DNA分子，然后加PCR扩增系统放大结合于固相的DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测放大的PCR产物。
近几年来，科技界陆续提出了免疫基因组学、肿瘤免疫组学、免疫组学、抗原组学、抗原表位组学等新概念。这些概念的提出，表示继基因组、蛋白质组之后在科学上又一个新领域的产生；对生物技术来说，基因组研究的应用，通过抗原表位组学、抗体组学和抗原表位组学与抗体组学是建立在基因组学和蛋白组学基础上的新兴领域，正在成长为继基因组和蛋白组后的科学热点。应用相关的学科的zui新成就，结合相关的技术，经过建立抗原表位库和抗体库，高通量筛选抗原靶标和抗原表位，可大大加速诊断、治疗药物靶标的筛选和研究与开发的进程。

1995年，美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。
PCR，中文译为聚合酶链式反应，其实是一种DNA的快速扩增技术，其扩增效率之高就象核裂变的“链式反应”那样。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热的酶的作用，可以在3个小时内把特定的DNA量提高1000万倍。这种技术一问世，立刻引起了分子生物学研究的一场革命，人们利用这种轰动全世界的技术很快就把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步。可以这么说，PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，而且随着PCR技术的日趋完善，PCR在人类社会生活中的应用也越来越广泛。比如说在“DNA指纹”中我们提到，科学家们只需要一根头发甚至一个细胞就可以完成DNA指纹的鉴定工作，这里实际上就要采用PCR技术，因为一个细胞中的DNA含量实在太少了，人们根本不可能检测到它的指纹；有了PCR技术就好办了，通过PCR技术把这个细胞中的DNA断扩增1000万倍，这样DNA量就足够作指纹鉴定了。再比如，在医院里检验血液中的某种病毒，有时病毒量极少（例如有的艾滋病病毒携带者），通过传统的检查方法费力又费时，这时PCR技术也许就可以帮上忙。可以先选定这种病毒DNA上的一段DNA，设计合适的引物DNA，然后通过PCR技术一扩增很快就可以判断出血样中是否扩增出了大量的DNA，如果是的话，那么就说明血样中带有该种病毒了。PCR方法不但有极高的灵敏度，而且可以同时一次做近百个扩增反应，省时省力效率高。
PCR技术神奇就神奇在以下几个特点上：一是被扩增的DNA所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，目的基因的量成指数形式扩增，几个小时就扩增1000万倍以上。现在PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面，真不愧是“获得诺贝尔奖”的好技术！

免疫PCR技术（Immuno-PCR）90年代初提出了抗体库技术。抗体库技术简单地说就是用细菌克隆取代B细胞克隆来表达抗体库（repertoire）。由于RT-PCR技术的发展，大肠杆菌直接表达有功能性抗体分子片断的成功以及噬菌体显示技术（phage display）的问世，在90年代初出现噬菌体抗体库（phage antibody library）技术，该技术使得人们从应用DNA重组技术改造现有的单抗发展到用基因工程技术克隆新的单抗，从而使抗体工程进入一个全新的时期。
噬菌体抗体库 继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的是噬菌体抗体库技术。Winter等人在1994年创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛（panning），在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的研究推向了新高潮。

1.方法简单易行，节省时间。可通过发酵生产、大量制备。
2.筛选容量增大，可在数周内筛选100万-1亿个克隆，可获得高亲和力的人源化抗体。
3.可直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因或IgV区基因，因此可以获得完全人源化的抗体，克服了人杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术。
4.可模仿体内免疫过程，模拟天然全套抗体库，方便的“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。
随着基因工程抗体技术的发展，在我国有些实验室开始了噬菌体抗体库的构建。用抗体库技术可直接制备人源抗体，例如利用被病原微生物感染的病人外周血细胞制备噬菌体抗体库，用特定抗原进行筛选，获得抗乙肝表面抗原、甲肝病毒的人源抗体。抗体库技术也被用于抗体性能改良，例如用链替换方法，以亲本抗体的一条链（轻链）与另一条链 （ 重链）的文库组合，构建抗体库，筛选高亲和力的克隆，再固定重链，用同样方法选择具有更高亲和力的轻链。一些特异性好、有应用前景的鼠抗体，利用抗原表位定向选择（EGS）方法，以鼠单抗可变区为模板，经噬菌体展示技术，通过抗原导向，筛选能够模拟鼠单抗可变区、结合相同抗原决定簇的人抗体，经这一方法获得人源抗体。国内也有实验室在计算机辅助设计下，将鼠抗体表面氨基酸残基“人源化”，主要将鼠 Fv段表面暴露的骨架区残基中与人Fv不同者改为人源性，使Fv的表面人源化，但仍保留其与抗原结合的特性。目前的问题是，有很多试剂型抗体或诊断用抗体进入市场，而治疗用抗体只有少数进入临床试验。分析主要原因，一是工程抗体表达量低。国内很多实验室，真核细胞中抗体表达量在1 毫克／升以下，很难用于生产。仅个别实验室在对载体进行改造后，抗体表达量达到40毫克／升。二是动物细胞规模化培养技术还不成熟，与国外相比存在很大差距。由于技术和经费等原因，我们动物细胞培养的规模zui大为50升，培养方式大多是采用微载体，悬浮批次和悬浮灌流尚属空白。在噬菌体抗体库的基础上，在近几年又发展了核糖体展示抗体库技术。核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程的将来发展趋势。