简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用

发布时间：2019-03-04 19:23 原文链接：简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用

随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。

核酸探针是将已知核苷酸序列DNA pian段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli。选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。

1 核酸探针的特点：

1.1探针的特异性

核酸探针检测技术的zui大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，他们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶DNA序列。另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏作用，所以用比提取蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然RNA探针除外，因为RNA不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA。核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格条件下（低温高盐）探针与靶DNA误交结合力比严格条件下稳定。探针长度也会影响反应的特异性，一般加Formamide增加反应特异性。

1.2 探针的敏感性

研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P标记物通常可检出10－8摩尔特异DNA pian段，相当于0.5pg，1000个碱基对的靶系列，相当于1000－10000个细菌。用亲和素标记探针检测1小时培养物DNA含量在110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1ng的水平。延长培养时间，增强信号强度能提高探针的敏感性。非放射性物标记探针在高浓度情况下，由于抑制了非特异性吸附，比放射性物标记探针背景干扰小。在探针上加生物素化的核苷酸长尾能使检测敏感性提高10倍。细胞中rRNA比rDNA多，检测rRNA比rDNA敏感。通过扩增DNA含量也能提高检测敏感性。

2 核酸探针技术在食源性病原微生物检测上的应用

2.1 沙门氏菌

食品中沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告zui少需四天，阳性报告还要延迟2－3天。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有2000多个血清型，还不清楚它们是否存在共同特异性的致病因子。Fillal等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别350株不同的沙门氏菌。由于该方法zui小检出量只有1个细菌/25克样品，所以需要增菌培养。AOACzui近认可了Gene-Tark沙门氏菌比色分析法，这种探针标记物为异硫氰酸荧光素（FITC）,再用辣根过氧化物酶标记抗FITC的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶浸染棒固相薄膜上杂交，对239株沙门氏菌的特异性检出率为100%，假阳性率为0.8%(BAM/AOAC培养法假阳性率为2.2%)。

2.2 大肠杆菌

大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。Tark研制出用浸染棒检测大肠杆菌中16srRNA的探针。样品需要前增菌处理，以异硫氰荧光素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体检测杂交复合物。Hsu等报道其特异性达100%，假阳性率为1.2%（目前使用的BNM/AOAC法为23.4%）。Sander等构建了一个能检测产生与志贺氏菌毒素相同毒素的大肠杆菌菌株（SLTEC）的探针。增菌后能检测牛肉和其它食品中是否存在有SLTEC。1990年Feng.p等研制出大肠杆菌GUD（β－葡萄糖醛酸酶）基因的探针，GUD是AOAC认可的MUG（4－甲基伞形酮β－葡萄糖醛酸）试验中检测的酶，现用PCR法扩增GUD基因，再用DNA探针杂交。MUG试验既MUG在GUD作用下释放出4－甲基7－羟香豆素，它在长波紫外光照射下产生蓝色荧光。

2.3 李斯特杆菌

1981年首次确定它是一种食源性病原菌，1985年加利福尼亚发生爆发性流行，现用检测方法大多采用冷增菌，费时费力。FDA于1987年zui新研制出针对李斯特菌致病基因β－溶血素的探针，随后GENE-TARK研制出商品化检测李斯特菌的DNA探针，它能特异性识别细菌的16SrRNA。该探针是由人工合成的寡核苷酸，用比色法检测样品；需先在LEB中培养16－22h,然后浸染比色检测。
2.4 弧菌国外对DNA探针和单克隆抗体法在检测鞭毛方面作了比较，结果发现DNA探针法阳性检出率高。近年来用PCR扩增DNA pian段，再做探针检测，能检出新鲜龙虾仁中的弧菌，检测灵敏度为10个细菌/克，但要用凝胶电泳进一步鉴定。因此不太适合检测食品。1989年Olive构建了一个热稳定溶血素基因的寡核苷酸DNA探针检测副溶血弧菌。