单核苷酸多态性（SNP）实验

单核苷酸多态性（SNP）实验

液氮PBSGA缓冲液GB缓冲液蛋白酶K无水乙醇蛋白液漂洗液

离心管离心机废液收集管吸附柱水浴锅分光光度计低温冰箱

一、DNA抽提

1.  取新鲜肌肉组织约100 mg，PBS漂洗干净，置于1.5 ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。
 

2.  加200 ul 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。加入20 ul 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混匀。
 

3.  加220 ul  缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。加220  ul 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
 

4.  将上述一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中，（吸附柱放入废液收集管中）12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。
 

5.  加入500  ul  去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。
 

6.  加入700  ul 漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm离心30 秒，弃掉废液。加入500 ul 漂洗液GW，12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中，12 000 rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。
 

7.  将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中，加入100 ul 洗脱缓冲液（洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热），混匀，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30 秒。洗脱第二次，将洗脱缓冲液50  ul 加入吸附柱中，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30 秒。
 

8.  采用Beckman DU 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA 浓度，在OD₂₆₀ 处有显著吸收峰。同时检测纯度，OD2_60/280 的值应为为1.7-1.9。
 

9.  从原液中取出相应体积DNA 溶液，稀释致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀释液置于-20℃保存。
 

二、 PCR扩增目的片段
 

1.  按相关的试剂说明在标准反应管中准备反应体系，典型的PCR反应体系如下（20 ul体系）：
 

2.  向左扳动仪器盖子上的手柄，揭开仪器盖子，小心放置样品管于仪器的相应样品孔中，轻轻盖上盖子，将顶部的旋钮慢慢旋紧，让热盖紧密接触样品管，样品放置完毕。
 

三、 在T1型PCR仪上编辑一个程序
 

1.  按[C programs]进入编辑模式。要在主目录中创建一个程序请按[D enter]。要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键选择一个子目录。按[D enter]进入选择的子目录。
 

2.  输入程序中要求的温度：用[D enter]确认温度。为其输入时间，用小数点来间隔。顺序为h.m.s。用[D enter]确认时间设置，或者用光标键移动到下一个区域。＃表示循环的次数。设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。用[C pgm ok]来储存一个完整的程序。程序数据永久的储存在记忆中。
 

四、运行程序
 

按[B start/stop]选择一个程序。用→↑↓键选择一个子目录，或者用[D enter]进入主目录。输入您想要启动的程序的号码。或者，按[A list]在该子目录中的所有程序的列表中选择一个程序。用↑↓键在列表中滚动选择。用[D enter]确认用强光突出的程序。按[D start]启动程序。
 

五、控制测试过程
 

运行过程中，按A按钮，可以获得程序剩余的时间信息。运行完成后，按STOP按钮终止实验，按YES确认终止。小心旋开热盖，按照放置样品的操作顺序，打开盖子，取出实验样品，再盖上盖子，关闭电源，本次实验结束。
 

六、 PCR产物测序
 

由专门负责测序的服务公司完成。
 

七、数据分析
 

少量可人工读取，大量可软件读取。比对发现的SNP在基因组中的位置：重点是启动子区、外显子区域（包括编码区的cSNP及5'及3'UTR）、剪切边界等，密码子的改变是否导致氨基酸的改变：错义突变、无义突变、终止突变。
 

1.  为保证待测目的区域测序真实可靠，引物设计应该使待测目的区域边界距离上下游引物至少各50 bp；
 

2.   引物设计建议使用在线方式，以保证成功率；
 

3.  为保证测序敏感性，PCR产物片段大小应在250 bp－650 bp范围；
 

4.  为方便实验，建议引物合成时分装成1 o.d/管，方便将PCR与测序的引物分开；
 

5.  为保证引物的特异性，建议引物设计后在NCBI上blast确认；
 

6.  为防止降解，PCR产物应尽快测序，否则应该保存在-20℃，且时间不宜过长；
 

7.  为保证结果真实性，建议对关键点进行反向测序确认。

SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究：

1、 SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP 遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。

2、 SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。

3、 SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。

4、 易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：（1）鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；（2）完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。（3）化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。

来源于郜金荣《分子生物学》化学工业出版社，2011