D D 由 Liang和 Pardee在 1992年首次提出。至今有大约1700篇 与 DD相关的文章发表,可见其影响巨大。许多与神经变性和凋亡相关的基因也通过DD 的方法得以鉴定。 .
DD的原理基于对cDNA分子进行随机扩增和随后按大小进行的分离。为此,首先需分离靶细胞或组织中总RNA,反转录为cDNA。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、.RNA 的分离1.一般原则差异显示技术成功最关键的因素就是RNA 的质量。为了最大限度减少RNA的降解应做到: —戴手套 一使用无菌器具。所有塑料器皿需在180℃ 过夜 —使用无RNA酶的玻璃器皿。所有的玻璃器皿都须在180L过夜一所有的缓冲液都必须去除RNA酶。因此,应使用DEPC处理过的重蒸水(将2.5 ml的DEPC力口入到2.5L的重蒸水中后高压) —冰上操作 2.组织勻浆
3.抽提
5.4℃15OOOg离心15 min。 4.RNA沉淀1.离心后将上层无色水相移入一个新的Eppendorf管。
2.每毫升TRIzoI中加入0.5 ml异丙醇。
3.振荡,室温解育lOmin。 4.4℃,12OOOg离心lOmin。 5.小心移去上清c 6.用75% 乙醇(每毫升TRIzol中加入Iml)洗涤RNA沉淀。 7.振荡。 8.在4℃ 下7500 g离心5 min。 9.小心移去上清。 10.将沉淀在空气中干燥15 min。
11.用DEPC处理过的重蒸(馏)水溶解沉淀, 注意:如果所有的RNA都直接用于cDNA 合成,则用11 ul ddH20将其溶解。 12.测量OD260/280值,计算RNA产量。 13.保存RNA,加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和2倍体积的无水乙醇。将RNA 分装成每份2.5ug 明置于-70℃。 5.RNA定量1.取出部分RNA(如总RNA产量的十分之一),加入 DEPC处理过的重蒸水至终体积为0.5 ml(若使用0.5 ml的石英比色皿)或Iml(Iml的石英比色皿)。
2.测量260/280的OD值。 3.确定RNA产量和质量。 一 260OD值为1相当于40yg/ml的RNA 一 260/280的OD比值为2说明为RNA纯品
6.DNA酶处理为了防止可能的基因组DNA的污染,用不含RNA酶的DNA酶处理样品。 1.用IX的DNA酶缓冲液溶解RNA沉淀。 2.加入5U DNA 酶。 3.37℃ 下孵育15 min。 4.用DEPC处理过的重蒸(馏)水增容,如可至300ul。 5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇。 6.剧烈振荡。 7.在4℃ 下13OOOg离心4 min。 8.将上层水相转入一个干净的Eppendorf管,用分光光度计测量RNA样品的质和量。 9.沉淀RNA在-70℃ 保存。 7.RNA质量的控制用1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,EB染色。需使用髙压灭菌的缓冲液、玻璃器皿、电泳前用0.5mol/LNaOH清洗电泳槽。 一应清楚地看到18S和28SrRNA条带 一如果无条带或条带染色很淡,并且绝大多数EB染色都位于凝胶底部,说明RNA发生降解,不能用于差异显示 二、cDNA 合成1.一般原则每种RNA使用4种不同的引物[即(E)T12MA,(E)T12 MG,(E)T12MT,(E)T12MC]进行4种不同的 cDNA合成反应。而且,每一种引物都设一阴性对照。 因此,每一种RNA样品需要有8个cDNA合成反应。 2.RNA变性1.加入2.5fxg总RNA和DEPC处理过的重蒸(馏)水至总体积为10ul。 2.根据DD类型,加入2ul(25umol/L)引物。 3.混匀。 4.70℃ 下孵育lOmin。 5.直接放置在冰上。 注意:70℃ 下孵育将破坏mRNA 分子的三级结构。若将试管从70X:移至室温,则RNA会再次退火,减少全长cDNA 分子的合成。 6.在冰上加入: —4 ul 5X first strand缓冲液 —2 ul 0.1mol/L DTT 一I ul dNTPs(10 mmol/L) —共19 ul 7.混匀并将试管放入25℃ 水浴。 8.孵育lmin。 9.加入1 ul反转录酶(200单位)或1 ul重蒸水作为对照。 10.混匀、孵育lOmin。 11.将试管放入42℃ 水浴。 12.再孵育50 min。 13.在70℃ 下孵育 IOmin使反转录酶热失活。 14.离心10s,将附于试管上的凝集水去除。 15.在4℃ 下保存cDNA样品 三A.DD-PCR1.一般原则在所有与PCR相关的移液步骤中使用带滤膜的枪头。 2.方案用重蒸水将20fxlcDNA样品稀释至100 Ml。在PCR 反应中取用4稀释液。
3.PCR反应
加入如下成分: —4 ul cDNA 一4 ul 10X缓冲溶液(其中包括:Taq酶) 一2 ul Mgcl2 —2 ul dNTPs(1mmol/L) —4 ul DIG 标记的T12MN(2.5/umol/L) —4DD-digo(5umol/L) —18 ul ddH2O —2 ul Taq酶(0.2U/ul) 总共40 ul
4.PCR 过程一 94℃,3 min;37℃,5 min;72℃,1min 一然后:95℃,30s;38℃,2.5 min;72℃,45s; 循环 39遍 —72°C,5 min
5.凝胶电泳我们应用一种直接印渍装置(GATC1500), 可以将DD-PCR 产生的 cDNA 片段按照大小分离。这种仪器是专门用于分离和检测PAA 凝胶电泳的过程中直接印溃在尼龙膜上的地高新标记DNA 分子。通过抗-DIG 抗体的染色可以显示膜上的DNA片段。这种系统的优点在于无放射性。而且,它的分离范围很广,可分离长度10?800bp的片段,而经典的 PAA凝胶电泳为10~300bp或150?500bp, 因此要减少PAA凝胶的用量。因为这套操作流程专用于此套设备而设计的,且它的解说详尽清晰,这里我们只阐述一些普通的注意事项。 1.为准确比较cDNA片段,将使用相同引物扩增的PCR产物相邻点样(图 2-2)。 2.假阳性的产生是DD的一个主要问题。为避免选取到假阳性产物进行下一步分析,可增加N数,即对于每一处理组分离多个RNA样本,分别进行cDNA合成以及PCR, 电泳时使同一组的样本相邻。在凝胶上,只有处理组中每个样本都出现确定的上调或下调的 cDNA片段才予以进一步的分析。遵循这样的原则,就不会出现假阳性的结果。 三B、EDD-PCR用ddH20将20cDNA样品稀释至25 ml,14用于PCR扩增。建议在第一次操作EDI>PCR 时,使用一系列不同稀释度的cDNA 以确定模板的最佳浓度。
1.PCR反应试管中加入: —I ul cDNA 一2 ul 10XPCR 缓冲溶液 II(与酶一同购买) —1.6 ul Mgcl2(25 umol/L) —3.5 ul dNTPs(0.5umol/L) 一2 ul 荧光 EDD 引物(2umol/L) —2 ul BlDD 引物(2umol/L) —0.4 ul BSA(10 mg/ml) —7.1 ul ddH2O —0.4 ul Amplitaq Gold(5U/ul) 总共 20ul。
2.PCR 过程一95°C,1Omin —95℃,30s;38℃,2 min;72℃,2 min; 循环 4 遍 —95°C,30s;60t:,lmin;72℃,1.3 min; 循环30 遍
3.焚光标记的EDD-cDNA片段的凝胶电泳我们用自动 DNA 测序仪分析了荧光 EDD-PCR产生的cDNA片段(图2-3)。采用 GATC 装置,本反应系统的优点在于不需通过放射性物质来检测 DNA分子,并且可分离长度范围很大(10~1200bp) 的片段,因而所需的PAA-凝胶也较少。使用自动 DNA 测序仪的另一个突出的优点就是可以用专门软件进行 DNA 序列自动分析,并将 EDD-数据进行数字化保存。因为自动 DNA 序列仪需要详细的操作指南,这些已经超出了本书的范围,在此就不做进一步介绍了。 4.一般原则1.本方案中使用了非放射性标记。作为标记方法通常不会影响酶(如逆转录酶或 Tag 聚合酶)的活性,这一方案同样适用于其他包括放射性标记在内的标记物。 2.分离目的EDD-PCR 片段: (1) 加入(32P-a)dATP, 再做 4~6 个反应循环。然后可用常规 PAA凝胶电泳分离片段。 (2) 加入DIG标记引物,再做 4~6 个循环。然后将产生的片段印溃到反应膜上。一半膜可用抗-DIG抗体染色来定位片段,另一半则切下含相应的目的片段的膜。’沸水煮膜 lOmin,洗脱 DNA,进行 20~25 个 PCR反应循环。用琼脂糖凝胶电泳鉴定分析所得片段并克隆,在这一流程中应该避免: 一用 HykmdN+, 因为这种尼龙膜结合 DNA的能力非常强,煮沸后 DNA 将不会被释放 一膜印迹后交联 DNA, 这样也会阻碍煮沸后 DNA的洗脱 |