酵母前体mRNA剪接提取物实验

tRNAUTPRNA 聚合酶

YPTris-HClETDASDS甘油HEPES 钾盐DTTPMSF磷酸钾缓冲液D-山梨醇SB 缓冲液等渗液裂解液AGK 缓冲液TBETE亚精胺转录缓冲液NTPATP二氯乙酸乙酸钠RNA 洗脱缓冲液乙酸铵乙醇染色液蛋白酶 K 溶液乙酸钠-EDTA 溶液Tris 碱平衡酚过硫酸铵硅烷化溶液RNasin

离心机摇床Dounce 匀浆器瓷质研钵研杵透析袋Dewar 烧瓶防低温手套真空滤膜架电源玻璃板聚四氟乙烯梳子和垫片黄色胶带聚丙烯培养试管Quicksep 柱台式振荡器旋转真空浓缩仪

一、材料与设备

1. 剪接提取物制备用溶液

除非另有说明，所有溶液均以蒸馏水制备。

(1) YP：加 20 g 酵母提取物和 40 g 蛋白胨（hacto peptone ) 到 1 L 的去离子水或者蒸馏水中。加 50 g 无水 D-葡萄糖到 70 ml 水中并在加热盘上搅拌溶解，用水补充至 100 ml 以制备 50% ( m/V ) 的葡萄糖溶液。将 YP 在一带塞的 2800 ml Fcrnbach 烧瓶或者 4 L 烧瓶中高压灭菌，50% 葡萄糖存放在带螺丝帽的瓶中，于室温储存。使用前每升 YP 加 40 ml 的 50% 葡萄糖。葡萄糖在高压火菌后再加入 YP 中，以防止因高压灭菌过久而焦糖化。

(2) 1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.6，pH 7.8 和 pH 8.0）：加 30.29 g Tris 碱到 125 ml 水中，接着加入 92 ml 1 mol/L HCl。用 1 mol/L HCl 滴定调 pH 至 7.6，7.8 或者 8.0，加水至 250 ml。高压灭菌后室温保存。

(3) 4 mol/L NaCl，高压灭菌后室温保存。

(4) 0.5 mol/L ETDA ( pH 8.0 )：加 18.6 g 的 EDTA ( 二钠二水合物形式）到 75 ml 的水中溶解 EDTA 并用 10 mol/L NaOH 将 pH 调至 8.0。加水至 100 ml。高压灭菌后室温保存。

(5) 10%（m/V）SDS，室温保存。

(6) 50%（m/V）甘油，高压灭菌后室温保存。

(7) 1 mol/L MgCl₂，高压灭菌后室温保存。

(8) 2 mol/L KCl，高压灭菌后室温保存。

(9) 1 mol/L HEPES 钾盐（HEPES-K⁺），23℃ 时 pH 为 7.8：加 119.2 g HEPES 和 20.1 g KOH 到 400 ml 的水中，加水至总体积 500 ml。稀释一小份样品到 10 mmol/L，检测 23°C 时其 pH 是否为 7.5，必要时可用 2 mol/L HCl 调节 pH。在 4℃ 其 pH 应为 7.8。高压灭菌或者过滤除菌后于 -20℃ 保存。溶液在高压灭菌后可能有点发黄，但不影响使用。

(10) 1 mol/L DTT：DTT 固体储存在 -20°C，该溶液保存于 4℃，应该在 24 h 内使用。

(11) 0.5 mol/L PMSF，-20℃ 保存。

(12) 1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.6）：慢慢将 8.85 g KH₂PO₄ 和 75.75 g K₂HPO₄ 加入到 400 ml 水中，溶解后，其 pH 应该是7.6，然后把总体积调到 500 ml 并高压灭菌。室温保存。

(13) 酶解酶溶液 ( zymdyase)：用 20 mmol/L 磷酸钾、5% 葡萄糖的缓冲液配制 20 mg/ml ( pH 7.6 ) 的酶解酶溶液，用前配制。酶解酶-100T ( 100000 U/g ) 固体于 4°C 储存。从 1 L 的细胞培养物中制备提取物需 10 mg 的酶解酶。酶解酶不能完全溶解，但不影响使用。

(14) 2 mol/L D-山梨醇：高压灭菌，室温保存。

(15) SB 缓冲液：1 mol/L 山梨醇，50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.8），10 mmol/L MgCl₂，室温保存。加 1.5 ml 的 1 mol/L DTT 到 50 ml 的 SB 中以制备新鲜的 SB+30 mmol/L DTT。加 0.75 ml 的 1 mol/L DTT 到 250 ml 的 SB 中以制备新鲜的 SB+3 mmol/L DTT。

(16) 等渗液：1 mol/L 山梨醇，以水稀释 2 mol/L 山梨醇至 1 mol/L。

(17) 裂解液：0.1%（m/V）SDS，50 mmol/L EDTA。

(18) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl₂，20 mol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。新鲜制备并置于冰上。加 1 ml 的 1 mol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，150 μl 1 mol/L MgCl₂，1 ml 2 mol/L KCl 和 50 μl 1 mol/L DTT 到97 ml 的灭菌水中，仅在使用前才加入 100 μl 0.5 mol/L PMSF。注意 PMSF 在水溶液中的半衰期大约为 30 min。加入 PMSF 时会产生少量沉淀但不影响使用。

(19) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.8)，0.2 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，20% 甘油( V/V )，1 mmol DTT，0.5 mmol/L PMSF，从 1 L 细胞培养物中制备提取物，须提前一天准备 2 L 的缓冲液 D。高压灭菌，置冷室冷却过夜。在透析前加 1 ml 1 mol/L DTT 和 1 ml 0.5 mol/L PMSF。

(20) AGK 缓冲液：10 mmol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl₂，200 mmol/L KCl，10% （V/V）甘油，0.5 mmol/L DTT 和 0.5 mmol/L PMSF。使用前才加 PMSF。

2. 体外转录和剪接分析用溶液

(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA（pH 8.3）。室温保存。

(2) 1X TBE：用蒸馏水或者去离子水稀释 10XTBE 至 1XTBE，室温储存。

(3) 1XTE：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6 )，1 mmol/L EDTA。室温储存。

(4) 30%（m/V）PEG₈₀₀₀，50℃ 加热溶解，高压灭菌，溶液冷却后分装为每份 1 ml 和 10 ml，于 -20℃ 储存。

(5) 1 mol/L 亚精胺：1.27 g 三盐酸亚精胺（spermidine trihydrochloride ) 溶于 3.5 ml 灭菌水中，用 10 mol/L NaOH 调整 pH 至 7.6，加水到 5 ml。-20℃ 保存。

(6) 10X 转录缓冲液：0.4 mol/L Tris-HCl（pH 7.8)，60 mmol/L MgCl₂，40 mmol/L 亚精胺。500 μl 每份储存于 -20℃。

(7) 0.1 mol/L DTT：用水稀释 1 mol/L DTT 至 0.1 mol/L，500~750 μl 每份储存于 -20℃。

(8) 10X NTP：ATP、GTP、CTP 各 5 mmol/L，UTP 1 mmol/L( pH 7.0)，储存于 -20℃ 使用时 37℃ 水浴迅速解冻并放在冰上。

(9) 100 mmol/L ATP：储存于 -20℃。使用时 37℃ 水浴迅速解冻并放在冰上。

(10) 二氯乙酸（TCA)：将 500 g TCA 加入 227 ml 的水中制备 100% TCA。在量筒中分别稀释 10 或 20 倍以制备 10% 和 5% 的 TCA。

(11) 3 mol/L 乙酸钠（NaAc) ( pH 5.4)：加 40.82 g 的二水乙酸钠至 75 ml 水中，加冰乙酸调 pH 到 5.4，最后加水至 100 ml。高压灭菌，室温保存。

(12) RNA 洗脱缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6)，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，2% ( V/V ) 苯酚（Tris EDTA 或 NaAc-EDTA 平衡），4°C 保存。

(13) 7.5 moI/L 乙酸铵（NH₄Ac）：用 0.2 μm 孔径的滤器除菌，4°C 保存。

(14) 70% ( V/V ) 乙醇：室温储存。

(15) 染色液：10% 溴酚蓝，10% 二甲苯蓝，室温保存。染料可能不完全溶解，但不影响使用，使用前用力摇晃。

(16) 去离子甲酰胺，pH 大于或等于分装成 1~10 ml 每份，于 -20°C 储存。储存超过 6 个月时须检查其 pH，如果 pH 低于 6.5 需进行去离子处理。

(17) 转录产物上样缓冲液：98% 甲酰胺，50 mmol/L EDTA，溴酚蓝和二甲苯蓝各 0.1%。-20℃ 储存。

(18) 蛋白酶 K 溶液：2.5 mg 蛋白酶 K 溶于 1 ml 4% ( m/V) SDS、50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.8)，0.25 moI/L EDTA 混合物中。1 ml 每份储存于 -20°C。

(19) tRNA：于 10 ml 的无菌水中溶解 100 mg 的 E.coli tRNA，0.5~1 ml 每份，储存于 -20℃。

(20) 剪接分析终止缓冲液：混合 200 μl 的 tRNA 和 1 ml 的蛋白酶 K 溶液。0.2~0.5 ml 每份，储存于 -20℃，使用时在 37℃ 融化并保持在 23~25℃ 以防止使用时 SDS 沉淀。

(21) 剪接分析用上样缓冲液：0.1X TBE，8 mol/L 尿素，溴酚蓝和二甲苯蓝均为 0.1%。加 0.22 g 尿素（超纯）到 200 μl 无菌水中，65℃ 加热使尿素溶解。加此尿素溶液 200 μl 至 94 μl 水、3 μl 的 10X TBE 和 3 μl 染色液（10% 溴酚蓝，10% 二甲苯蓝）中，此缓冲液需当天使用。

(22) 乙酸钠-EDTA 溶液：300 mmol/L NaAc ( pH 5.4)，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaAc ( pH 5.4)，100 mmol/L EDTA。室温储存。

(23) 1 mol/L Tris 碱，高压灭菌后在室温储存。

(24) Tris-EDTA 平衡酚，4°C 可储存 1~2 天，长期储存应冻存于 -20°C。当有机相变成淡橙色时应弃用。

(25) NaAc-EDTA 平衡酚：65℃ 加热 500 g 分子生物学级的酚并加入 0.5 g 8-羟基喹啉，然后加入 500 ml 300 mmol/L NaAc ( pH 5.4)、50 mmol/L EDTA 溶液，用搅拌器快速混合 10 min，停止搅拌并让液体分成水相与有机相，吸弃上层的水相，再加入 100 ml 300 mmol/L 新配制的 NaAc ( pH 5.4) 和 50 mmol/L EDTA，快速搅拌 5 min，静止使液体分相，并吸弃大部分的上层水相，无机相上层剩余约 2 cm 厚的水相。4℃ 可储存 1~2 天，长期储存应冻存于 -20°C。当有机相变成淡橙色时应弃用。

(26) NaAc-EDTA 平衡苯酚：氯仿：异戊醇：加 20 ml 的异戊醇到 480 ml 的三氯甲烷中，然后将该溶液倒入 500 ml 的用 NaAc-EDTA 平衡的苯酚中，快速搅拌约 5 min，使各相分层，储存方法同 Tris-EDTA 平衡酚。

(27) 氯仿：异戊醇（24 :1 )：在通风橱中操作并戴手套，倒 240 ml 的氯仿至一 250 ml 玻璃量筒中，加异戊醇使体积达到 250 ml。储存于带盖玻璃瓶里，通风橱中存放。

(28) 1X TBE、8 mol/L 尿素：加 240.2 g 尿素到 250 ml 温水和 50 ml 10X TBE 中。低温加热搅拌至尿素溶解，将溶液倒入量筒中，冷却后加水补充至 500 ml，于 4℃ 储存。若有尿素沉淀于 37℃ 水浴加热溶液至尿素溶解。

(29) 用 1X TBE、8 mol/L 尿素配制丙烯酰胺[ 29%（m/V）丙烯酰胺，1%（m/V）甲叉双丙烯酰胺 ]：为得到 5%（m/V）丙烯酰胺溶液，加 12.1 g 丙烯酰胺（电泳级）和 0.4 g 的甲叉双丙烯酰胺到 250 ml 的 1X TBE、8 mol/L 尿素中，搅拌至丙烯酰胺完全溶解。制备 7.5%( m/V ) 丙烯酰胺溶液，加 18.12 g 的丙烯酰胺（电泳级）和 0.63 g 的甲叉双丙烯酰胺到 250 ml 的 1XTBE、8 mol/L 尿素中并搅拌至丙烯酰胺完全溶解。两种丙烯酰胺溶液于 4℃ 在带螺帽的瓶中可储存一年。如果储存期间出现沉淀，在 37℃ 水浴加热直至沉淀溶解。

(30) 10%( m/V）过硫酸铵（APS ) 和 TEMED，过硫酸铵 4°C 可储存 1 周；TEMED 储存于 4℃。

(31) 硅烷化溶液：15%（V/V）二氯二甲硅烷溶解于氯仿中。储存于磨口玻璃瓶中，于通风橱中存放。

(32) 2%（m/V）NaHCO₃。

(33) 15%（V/V）甲醇，5%（V/V）乙酸，在带螺帽的瓶中室温储存。

3. 制备提取物用的设备和材料

(1) 摇床：要求能使用大的烧瓶，转速达 300 r/min 并能维持在 30℃，以培养酵母细胞。

(2) 离心机：具有适当转子的微型高速台式（或者临床用）离心机和超速离心机。

(3) 玻璃或金属的 Dounce 匀浆器。

(4) 12.7 cm 的瓷质研钵和研杵：初次使用时，用铬酸溶液处理研钵和研杵 15~30 min，然后用水彻底清洗。在研钵中注满 AGK 缓冲液，将研杵放入研钵，室温放置 30 min。最后用灭菌的蒸馏水彻底清洗研钵和研杵并风干。使用时用去离子水清洗，然后用灭菌的蒸馏水清洗并风干。

(5) 透析袋（1.27 cm 宽，截留分子质量>3500 Da）和 4 cm 透析袋夹。实验前一天按如下步骤处理透析袋：剪成 30 cm 长的条，在 4 L 的 2% 碳酸氢钠中煮沸 15 min，用大量的灭菌水洗 3 次。在紧密封闭的容器里，处理过的透析袋在 70% 乙醇中于 4℃ 可存放几年以上。在使用透析袋之前约 15~30 min，从乙醇中取出并挤掉过多的液体，在几百毫升的灭菌水中浸泡，然后用更多的灭菌水清洗。用 10~12 ml 新鲜的灭菌水冲洗透析袋内侧两次，浸入冷的缓冲液 D 中。

(6) 两个 350 ml Dewar 烧瓶。

(7) 0.5~10 L 液氮（N₂）。

(8) 防低温手套。

(9) 一个超低温（-70~-80℃）冰箱或液氮罐。

4. 体外转录和剪接分析用设备和材料

(1) [ α-³²P ] 尿苷三磷酸（UTP)：3000 Ci/mmol 和 10 mCi/ml。

(2) T7 或者 SP6 RNA 聚合酶。

(3) RNasin：40 U/μl。

(4) 支持 24 mm 过滤器的钢制真空滤膜架。

(5) Whatman 玻璃纤维（GF/C）24 mm 滤纸。

(6) 电源：可维持稳定的高达 1000 V 的电压和 100 mA 的直流电。

(7) 两块玻璃板（4 mm 厚）：一块尺寸为 19 cm 宽、16 cm 高，另一块尺寸相同，但有一 2.2 cm 深、16.3 cm 宽的槽。

(8) 聚四氟乙烯梳子和垫片。为纯化转录物，垫片和梳子应为 1.5 mm 厚，梳子 16 cm 宽、3 cm 高，7 个齿，齿间间隔为 2 mm，每个齿 1.4 cm 高、1.8 cm 宽，每个齿形成的孔最大体积 80 μl。用于剪接分析的梳子和垫片是 0.38 mm 厚，梳子 15.5 cm 宽，2.6 cm 深，14 个齿，齿间间隔为 4 mm，每个齿 8 mm 高、7 mm 宽，每个齿形成的孔可容纳 15 μl。

(9) 黄色胶带。

(10) 一次性带帽的无菌聚丙烯培养试管（12 mm X 75 mm 或 17 mm X 100 mm）和一次性带螺帽的无菌刻度圆锥形聚丙烯离心管（50 ml）。

(11) 空的 Quicksep 柱（Empty Quicksep columns）（Isolab、Inc、Akron、OH、USA）。

(12) X 射线片（20.32 cm X 25.4 cm），避光 X 射线片暗盒，增感屏，X 射线片处理设备。

(13) 硅烷化并烤过的玻璃棒、Corex 试管。

(14) 台式振荡器。

(15) 旋转真空浓缩仪（Spced-Vac concentrator）或冻干器。

(16) 3 MM Whatman 滤纸（46 cm X 67 cm）。

(17) 凝胶干燥器（可选）。

二、操作方法

1. 匀浆原生质球获取整细胞提取物

为尽可能得到有最大活性的提取物，要以最快的速度操作直至透析。

(1) 1 L 的酵母细胞培养物过夜培养到对数生长期的中后期。首先在 125 ml 或者 250 ml 的烧瓶中过夜培养 10~50 ml 酵母，第二天将其转移到 1 L YPD 中。使培养物在 30℃，以转速 250~300 r/min 培养过夜，使其密度达到 3X10⁷~5X10⁷/ml。对于酵母菌株 EJ101，30℃ 用 YPD 培养，倍增时间为 90 min。

(2) 收集酵母细胞。在高速离心机中 1200~1500 g 离心 5 min 收集细胞。采用 100 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重悬细胞并再次离心，再采用 30 ml 的 SB+30 mmol/L DTT 重悬细胞沉淀，室温放置 15 min。在 30 mmol/L DTT 中的孵育对后面的原生质球的形成十分重要。1500 g 离心 5 min，用 30 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重悬细胞并转入无菌的 120 ml Erlenmeyer 烧瓶。

(3) 酶解酶孵育细胞并监测原牛质球的形成。取 20 μl 两份细胞，将一份加到 1 ml 的等渗溶液中，另一份加到 1 ml 的裂解液中，通过测 λ₅₀₀ 的光吸收值来监测细胞的裂解。在细胞培养瓶中加入 250 μl 的酶解酶-100T 溶液，30℃ 50~60 r/min 缓缓摇 40 min。每 10~15 min 取出 20 μl 两份，分别加入 1 ml 的等渗溶液和裂解液中，测 λ₅₀₀ 的吸收值以监测原生质球的形成。当裂解液中的光吸收值为等渗溶液中光吸收值的 20% 或更少时，表明酶解达到要求。

(4) 此前一步操作均需在冷室中进行以保持样品冷却。设备（包括吸管、转子和溶液）均要在冷室中过夜预冷。

(5) 匀浆裂解原生质球。用一无菌硅烷化的玻璃棒轻轻地使原牛质球重悬于冷的缓冲液 A 中，1 L 培养物（4X10⁷~5X10⁷ 细胞/ml）用 8 ml 缓冲液 A。然后将原生质球转移到一冷的 7 ml 或者 14 ml Dounce 匀浆器中，匀浆器置于冰上匀浆 5~10 次。

(6) 0.2 mol/L 氯化钾处理匀浆液以从核中释放剪接因子。匀浆液倒入 15 ml 带刻度的一次性无菌圆锥离心管中，记下匀浆液的体积。如果在匀浆液中有大量气泡，用冷却的台式离心机短暂离心（2 min）以消除气泡。匀浆液倒入置于冰上的带有一个小搅拌子的 25 ml 玻璃烧杯中，缓缓搅动（约 60~120 r/min）10 min。用吸头慢慢（2 min）加入 0.9 倍体积冷的 2 mol/L KCl 至终浓度为 0.2mol/L，再缓缓搅动 30 min。

(7) 通过两次离心沉淀细胞碎片和细胞器，将匀浆转移到 10 ml 或者 30 ml 的螺帽 Oak Ridge 试管并在 4℃ 以 33000 g 离心 30 min 以沉淀大的碎片。在冷室从转子中取出试管，吸取上淸转移到一个厚壁聚碳酸酯的带螺帽试管中，然后于 4℃ 100000 g 离心 1 h。

(8) 透析提取物。把离心机转子移到冷室中，小心取出试管并放到试管架上，打开盖子。样品分为三层：薄的上层包括脂类和脂蛋白；厚的中间层为澄清的淡黄绿色，包括大部分的剪接活性物质和一些核糖体；底层则为清晰的淡棕色，包括细胞器、核糖体和大的细胞碎片。从缓冲液 D 中取出透析袋，戴上手套，挤掉多余的液体，以夹子封闭一端。用冷的无菌巴斯德吸管吸取黄绿色的中间层液体，小心操作，避免吸到上层或底层。提取物吸到透析袋中，约 6~8 ml。挤去袋中的空气，用夹子在接近提取物的地方夹住透析袋。将透析袋置于一个装有 1 L 缓冲液 D 和一个无菌磁力搅拌子的无菌烧杯中。将烧杯放在冰槽中，周围放上冰，冰槽则放在冷室中的磁力搅拌器上。1.5 h 后更换缓冲液 D，共搅拌透析 3 h。提取物更多时可增加缓冲液 D。

(9) 离心去除透析时产生的沉淀。透析后，提取物的量可能减少 1~2 ml，从透析缓冲液中取出透祈袋，用纱布擦去袋外的液体，打开上端的夹子，用一冷的无菌巴斯德吸管吸出提取物转移到一冷的 Oak Ridge 试管或者几个冷的微量离心管中。在 4℃ 以 12000~14000 g 时离心 10 min。

(10) 保存提取物。以每管 100 μl，200 μl 或者 500 μl 将提取物分装到置于冰上的微量离心管或冻存管中。快速冷冻后在液氮或者 -70℃ 冰箱中保存。

(11) 1 L 酵母培养物可得到 6 ml 提取物，每毫升约含蛋白质 20~30 mg。

2. “冷冻断裂” 法获得全细胞提取物

(1) 如上所述方法培养酵母细胞。以 1500 g 在 4℃ 离心 10 min 收集细胞。

(2) 准备细胞。将细胞在 50~100 ml 冷的 AGK + PMSF 缓冲液中重新悬浮，在 4℃ 以 1500 g 离心 10 min，从这一步开始样品要保持冰冷。倒出上清并加入 20 ml 新配制的冷 AGK+ PMSF 缓冲液重悬浮细胞，将细胞悬液转移至无菌的 50 ml 聚丙烯刻度