| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | NaOHHClNaClMgCl2乙醇1-丁醇苯酚 氯仿 异戊醇EDTAPCR 缓冲液ATP 琼脂糖ATP-适配体筛选结合缓冲液ATP-适配体筛选洗脱缓冲液鲑精 DNABSA3'引物5'引物Taq DNA 聚合酶 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 用 1 ml 去离子水洗涤 10 mg ATP-琼脂糖三次，然后用 1 ml ATP-适配体筛选结合缓冲液洗涤两次。 2. 取 1 ml 所得的纯化的 mRNA 显示蛋白与洗过的 ATP-琼脂糖于 4°C 下 旋转混合孵育 1 h。然后滴干，准备过柱。 3. 于 4°C 用 1000 ml ATP-适配体筛选结合缓冲液洗涤 6 次，每次洗涤 10 min。 4. 用 250 ul ATP-适配体筛选洗脱液于 4°C 下洗脱 6 次，每次洗脱 10 min。 5. 用闪烁计数法检测所有组分。 6. 往 1.5 ml 洗脱下的 mRNA 显示蛋白中加入 200 ul 100 mmol/L EDTA 和 200 ul 1 mol/L NaOH，于 90°C 加热 10 min， 冰上冷却，然后加入 200 ul 1 mol/L HCl。 7. 参照厂家的说明用 NAP-25 凝胶过滤将缓冲液置换为去离子水。 8. 使 25 ml 去离子水流过柱子。 9. 将 200 ul 10 mg/ml 鲑精 DNA 与 20 ul 1 mg/ml BSA 加入 1780 ul去离子水中，涡旋振荡，然后使此溶液流过凝胶过滤柱。 10. 使 25 ml 去离子水流过柱子进行洗涤。 11. 测量样品体积并流过柱子，然后往柱中加入一定体积的去离子水，使得上柱总体积为 2.5 ml。 12. 加入 3.5 ml 去离子水到凝胶过滤柱的顶端，然后从柱底收集 3.5 ml 流出的洗脱液。 13. 用 PCR 扩增筛选的序列。在冰上配制下列 PCR 反应混合物： 3500 ul 筛选的 cDNA 库（来自步骤 12） 100 ul 100 umol/L 3' 引物（最终为 2 umol/L） 100 ul 100 umol/L 5' 引物（最终为 2 mmol/L） 40 ul 25 mmol/L （每个）脱氧核苷三磷酸（最终为 0.2 mmol/L） 500 ul 10×PCR 缓冲液，含 15 mmol/L MgCl2 （最终为 1×） 735 ul 水 25 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 总体积 5000 ul 循环数、温度和每一循环所需时间需要视所用的特定的库而定。应当对 DNA 库的 PCR 扩增监控，避免 DNA 库的过度扩增，因为（过度的扩增使得 DNA 库）一旦变性后不会再复性。如果对一个变性的 DNA 库继续进行 PCR 扩增，极少的序列能达到普通序列的扩增程度，这会降低所筛选的功能序列的富集因子。 14. 与上述 PCR 并行进行一份非 RT 的对照 PCR。 15. 按照 1：1 等量摩尔数加入 100 mmol/L EDTA 以螯合 Mg2＋。 16. 加入等体积的 25：24：1 （V/V/V） 苯酚/氯仿/异戊醇到 PCR 反应混合物中，涡旋振荡，室温下于 10 000 g 离心 1 min。吸取上层水相保留。 17. 用等体积的氯仿重新抽提水相 3 次；每次通过离心分层，离心后弃下层有机相。 18. 用 1-丁醇抽提水相至起始体积的 20％，弃上层 1-丁醇相。 19. 加入 3 mol/L NaCl 至终浓度为 300 mmol/L （在计算浓度时应包含来自 PCR 缓冲液的盐浓度）和 2.5 倍体积的 100％ 乙醇。 20. 于 -80°C 冷冻 20 min 或于 -20 ℃ 放置过夜。4°C 下 12 000 g 离心 10 min。弃上清。 21. 沉淀于 12 000 g 离心 1 min， 用塑料吸头吸去残留的上清，溶解于 30 mmol/L NaCl， 用琼脂糖凝胶测量其浓度。 22. 重复筛选/扩增循环直至所得的 mRNA 显示蛋白在选择组分中的比例不再提高为止，通常需 8～12 个循环。 23. 将 DNA 转录成 RNA。 |
| 注意事项 | |
| 其他 | 1. 材料 纯化的 mRNA 显示蛋白 2. 试剂 ATP 琼脂糖（Sigma） ATP-适配体筛选结合缓冲液 ATP-适配体筛选洗脱缓冲液 100 mmol/L EDTA 1 mol/L NaOH 1 mol/L HCl 10 mg/ml 鲑精 DNA 1 mg/ml BSA 100 umol/L 3'引物（cDNA 库特异的） 100 umol/L 5'引物（cDNA 库特异的） 25 mmol/L （每个）脱氧核苷三磷酸 10×PCR 缓冲液，含 15 mmol/L MgCl2 （Boehringer Mannheim） 5 U/ul Taq DNA 聚合酶（Boehringer Mannheim） 25：24：1 （V/V/V） 苯酚/氯仿/异戊醇 氯仿 1-丁醇 3 mol/L NaCl 100％ 乙醇 3. 耗材 凝胶过滤柱（如 NAP-25，Amersham Pharmacia Biotech） |
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