| 实验材料 | DNA 聚合酶 I Klenow 片段限制性内切酶A 和 B单链 DNA 结合蛋白单链 DNA 模板T4 DNA 连接酶T4 DNA 聚合酶T4 多聚核苷酸激酶T7 DNA 聚合酶上游引物 |
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| 试剂、试剂盒 | 10 X 退火缓冲液ATP对叠氮化苯甲酰甲溴生物素-11-dATP生物素-11-dCTP生物素-16-dUTPC18HPLC 溶剂氯仿调控毛细孔玻璃板（CPG)-寡核苷酸合成的支持物dAdCdGTβ-氰乙酸亚磷酸铵dNTPs变性上样缓冲液DNA 聚合反应混合物EDTA洗脱液乙醇 |
| 仪器、耗材 | 放射自显影标准物放射自显影增感屏烧杯台式离心机CHROMA SPIN+TE-10 和 SPIN+TE-100 旋转柱DNA RNA合成仪固定角度的小离心管灭菌灯（254nm）HPLC 系统增感屏小离心管寡聚核苷酸纯化试剂盒（OPC)磷屏仪多聚丙烯圆底管解剖刀Spin-X离心滤器紫外分光光度计真空干燥器水浴或加热器 |
| 实验步骤 | 一、位点特异性生物素标记的 DNA 衍生片段的设计及预备1.化学反应
2.酶反应
二、蛋白质-DNA 复合体的制备及紫外照射1.轻轻摇动存储瓶，重悬顺磁性小磁珠。取出 3u1 的溶液转入一个硅化过的 1.5 ml 小离心管中，低速离心。 2.将管放入磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。 3.用 30jullX 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，用一微量吸管轻轻混勻，室温孵育磁珠 2 min。 4.低速离心。 5.将管放人磁性粒子收集器中，静置 30s 后去上清，重复步骤③?⑤。 6.用 10ul 2X 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，加人 2ul 60nmol/L 生物素标记的位点特异性 DNA 片段衍生物（从本方案 7.1 中步骤48获得）。25℃ 孵育 10 min，不时轻轻敲打管子以混匀液体。 7.将管子放入磁性粒子收集器中，静置 30s 后，将上清转入一支新的硅化的 L5 ml 小离心管中。 8.通过比较磁珠和上清的放射量来估算生物素标记位点特异性 DNA 片段衍生物的结合产率，若结合产率大于或等于 80%，可继续以下操作，若产率未达要求，则需从本方案 7.1 中步骤25 开始重复操作。
9.用 30ul 1 X 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，低速离心。 10.将管放人磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。 11.用 30ul l X 结合洗脱缓冲液，重悬磁珠，低速离心。 12.将管放人磁性粒子收集器中，静置 30s 后去掉上清。 13.用 1 X 蛋白质结合缓冲液重悬磁珠，使 DNA 达到预定浓度，加入预定浓度的蛋白质，在合适的温度下，经合适的时间孵育混合液，孵育过程中不时轻轻敲打管子侧壁，以使液体充分混匀。 在这一步及下面的操作中，DNA 和蛋白质的浓度、反应的温度和时间都根据以往的经验进行设定，或是根据已知的复合体内各组分相互作用的知识来确定。 14.低速离心。 15.将管放入磁性粒子收集器中，静置 10s 后弃上清。 16.用预先孵育到合适温度的 50ul 1 X 蛋白结合缓冲液，重悬磁珠，在合适的温度下孵育 2 min。 17.将管子放人磁性粒子收集器中，静置 30 s 后弃掉上清。
18.用预先孵育到合适温度的 20ul 1 X 蛋白结合缓冲液重悬磁珠，将混合液转入一支聚苯乙烯小离心管中，而后将管子插人一支预先孵育到合适温度的 13mmX100mm 的硼硅酸玻璃培养管中。 19.将管子放人光化学反应发生器中，用紫外线照射蛋白质 DNA 样品 20s(11ml/mm2 于 350nm)。 如果所需的反应温度高于或低于周围环境的温度至少 10°C 的话，可在硼硅酸玻璃培养菅中注满 H2O, 而后对其进行预孵育，直至 H2O 的温度达到合适的温度为止。 20.将悬液转入一支硅化的 1.5 ml 小离心管中，加入 7ul 的终止反应溶液，振荡混匀。 21.将管放入磁性粒子收集器中，静置 10 s，取出 17ul 的上清，立即进行第三部分的操作。 三、核酸酶消化
四、发生交联反应的蛋白质的鉴定
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