一、细胞融合前准备 1. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案 初次免疫 1×107/0.5 ml ip (腹腔内注射) ↓ 2~3周后 第二次免疫 1×107/0.5 ml ip ↓ 3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5 ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 (2)可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1~50 μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.8~1 ml 0.2 ml/点) ↓3周后 第二次免疫 剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5 ml) ↓3周后 第三次免疫 剂量同上,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价,检测免疫效果) ↓2~3周后 加强免疫,剂量50~500 μg为宜,ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如
①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。 2. 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系,常用BaLb/c小鼠6~10 周龄 ↓ 拉颈处死,浸泡于75 %酒精,消毒3~5 分钟 ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入6~8 ml培养液 ↓ 反复冲洗,吸出冲洗液 ↓ 放入10 ml离心管,1200 转/分离心5~6 分钟 ↓ 用20 %小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数1×105 /ml ↓ 加入96孔板,100 μl/孔 ↓ 放入37 ℃,CO2孵箱培养 一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得5~8×106 腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106 /ml,小鼠脾细胞为1×106 /ml,小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105 /ml,均为100 μl/孔。 3. 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10~20 %,细胞的最大密度不得超106 /ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3~5 天传代一次。细胞的倍增时间为16~20 小时,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性,每3~6月应用8~AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变。 保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态,活细胞计数高于95 %,也是决定细胞融合的关键。 4. 免疫脾细胞 免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞和浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏,制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较大,融合的成功率较高。 脾细胞悬液的制备
在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次,置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍,细胞数为2×108左右。 二、细胞融合,选择杂交瘤 1. 细胞融合流程 (1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0,1000 rpm离心5 分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2 次。 (2)同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2 次。 (3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50 ml塑料离心管内不完全培养液洗1 次,1200 rpm,8分钟。 (4)弃上清,用滴管吸净残留液体,以免影响PEG的浓度。 (5)轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。 (6)在室温下融合 ①30 秒内加入预热的1 ml45 %PEG(Merek,分子量4000)含5 %DMSO,边加边搅拌。 ②作用90 秒钟,若冬天室温较低时可延长至120 秒钟。 ③加预热的不完全培养液,终止PEG作用,每隔2 分钟分别加入1 ml,2 ml,3 ml,4 ml,5 ml和10 ml。 (7)离心,800 rpm,6 分钟。 (8)弃上清,先用6 ml左右20 %小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。 (9)根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10 ml一块96孔板。 (10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100 μl/孔,37 ℃、5 %CO2孵箱培养。 一般一块96孔板含有1×107脾细胞。 2. HAT选择杂交瘤 一般在融合24 小时后,加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存,用时1 ml加入50 ml20 %小牛血清完全培养液中。 因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200 μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择,可得到满意的筛选结果。 50×HAT H: 5×10-3M A: 2×10-5M T: 8×10-4M 一般选择HAT选择培养液维持培养两周后,改用HT培养液,再维持培养两周,改用一般培养液。 三、抗体的检测 筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。 常用的方法有 1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。 2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。 4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。 上述方法均为一般实验室的常规方法,故在此不介绍具体的实验过程。 可靠的筛选方法必须在融合前建立,避免由于方法不当贻误整个筛选时机。 四、杂交瘤的克隆化和冻存 克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。 1. 克隆化方案 用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。 (1)有限稀释法的程序 ①制备饲养细胞悬液(同融合前准备) ②阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103 /ml ③取130 个细胞放入6.5 ml含饲养细胞完全培养液,即20 个细胞/ml,100 μl/孔加A、B、C三排为每孔2 个细胞。余下2.9 ml细胞悬液补加2.9 ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10 个/ml,100 μl/孔加D、E、F三排,为每孔1 个细胞。余下2.2 ml细胞悬液补加2.2 ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5 个/ml,100 μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5 个细胞。 ④培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200 μl/孔。 ⑤第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。 注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。 (2)软琼脂法 ①软琼脂的配制 含20 %FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640 1 %琼脂水溶液:高压灭菌,42 ℃预热。 0.5 %琼脂:由1份1 %琼脂加1份含20 %小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42 ℃保温。 ②用上述0.5 %琼脂液(含有饲养细胞)15 ml倾注于直径为9 cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
③按100 /ml,500 /ml或5000 /ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④1 ml 0.5 %琼脂液(42 ℃预热)在室温中分别与1 ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10 分钟,使其凝固,孵育于37 ℃,5 %CO2孵箱中。
⑥4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。
2. 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。 杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。 细胞冻存液: 50%小牛血清 40%不完全培养液 10%DMSO(二甲亚砜) 冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0 ℃,再降温时一般按每分钟降温2~3 ℃,待降至-70 ℃可放入液氮中。或细胞管降至0 ℃ 后放-70 ℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 五、单克隆抗体的大量生产 大量生产单克隆抗体的方法主要有两种 1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10~60 μg/ml,如果大量生产,费用较高。 2. 体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。 (1)实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107 /ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2 ml, 共2~4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10~20天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10 mg/ml。但采血量有限。 (2)腹水的制备
常规是先腹腔注射0.5 mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1~10 ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20 mg/ml, 这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。 六、单克隆抗体的鉴定 对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定 1. 抗体特异性的鉴定
除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外,还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验,方法可用ELISA、IFA法。例如
(1)制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外,还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应,以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。
(2)制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应,其次是与其它细胞因子间有无交叉。 2. McAb的Ig类与亚类的鉴定
一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时,如加入适量的PEG(3 %),将有利于沉淀线的形成。 3. McAb中和活性的鉴定
用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。 4. McAb识别抗原表位的鉴定
用竞争结合试验、测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。 5. McAb亲和力的鉴定
用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。 展开 |