一、试剂盒内容 PVDF96孔板,室温保存;0.1 ml捕获抗体,4℃保存;0.1 ml生物素标记检测抗体,4℃保存;15 ul亲和素碱性磷酸酶标,4℃保存;0.25 g牛血清白蛋白,4℃保存;0.25 g脱脂乳,4℃保存;11 ml底物缓冲液,4℃保存;11 ml浓缩PBS(10X),室温保存;11 ml浓缩洗涤液(200x),室温保存。 二、试剂的准备
1. 10 ml磷酸缓冲盐(PBS,10X)以90 ml蒸馏水稀释;
2. 0.22 g脱脂乳用11 ml稀释的PBS溶解,最终浓度为2%;
3. 0.22 g BSA溶解于22 ml已稀释的PBS,最终浓度为1%;
4. 10 ml浓缩洗涤液(200x)以1990 ml蒸馏水稀释;
5. 10 ul亲和素碱性磷酸酶以10 ml PBS-1%,BSA稀释;
6. 7 ml酒精以3 ml蒸馏水稀释,最终浓度为70%。
三、Eli-spot操作过程 1. 用100 ul 70%酒精孵育PVDF孔板,室温下孵育10分钟。 2. 倒去酒精,用100 ul PBS洗涤3次。 3. 将100 ul捕获抗体加入10 ml PBS中,混合, 每孔加100 ul, 盖上板盖,4℃过夜。 4. 倒去液体,100 ul PBS洗涤一次。 5. 每孔加入100 ul 2%脱脂乳PBS(见试剂准备),盖上板盖,室温下孵育2小时。 6. 在水槽边和吸水纸上轻打,倒去液体。 7.用100ul PBS洗涤一次。 8. 每孔加入100 ul细胞悬浮液(含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂)。细胞可预先在体外接受刺激(间接Eli-spot)。盖上标准的96孔板塑料板盖,37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间(15-20小时)。这期间不要晃动或移动孔板。 9. 在水槽边和吸水纸上轻打,倒去液体。 10. 每孔加100 ul洗涤缓冲液,4℃孵育10分钟。 11. 用100 ul洗涤缓冲液洗孔3次。 12. 于10 ml PBS-1%BSA中稀释100 ul检测抗体,此为一板的量。每孔加100 ul此液体,盖上板盖,37℃下孵育1小时30分。 13. 倒去液体,用100 ul洗涤缓冲液洗3次。 14. 每板以10 ml PBS-1%BSA稀释10 ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100 ul此液体,盖上板盖,37℃孵育1小时。 15. 倒去液体,用100 ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打,吸干残留的洗涤液。 16. 每孔加入100 ul BCIP/NBT。 17. 室温下反应5-15分钟。完全显色后,将此液倒于相应的盘中。 18. 用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍,使膜干燥。保存时,将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后,读取点数。4℃下放置一夜,点会比较明显。 此板在室温下避光保存。使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的致癌物质,试验时带手套,使用后适当处理。对MAIPAN4510板,孵育时由于毛细作用,试剂渗入膜中,此液体难以洗去,因此导致背景增加。为了避免此情况,建议在步骤12时将板底移去,将膜倒转,用蒸馏水流冲洗,同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中,由于板底已移去,建议将MAIP4510板放于空的96孔板上,其后的步骤不变。 展开 |