实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 用自动 DNA 合成仪合成如下的 91-碱基的随机寡核苷酸和 17-碱基的引物。分别用水溶解使其终浓度为 1 ug/ul。 寡核苷酸 : 5'-GACTGACTGGTCCG (NNK)20GGTCCTCAGTCAGTCA-3'。此处 N 代表 A,G,C 或 T; K 代表 G 或 C。 引物:5'-CTGACTGACTGAGGACC-3'。
2. 按顺序加入下列试剂到一 1.5 ml 离心管中(终体积 890 ul): 200 ug 引物(过量 10 倍) 100 ug 随机寡核苷酸 490 ul 水 100 ul 10×Klenow 聚合酶反应缓冲液。
3. 水浴中加热样品到 95℃,孵育 5 min,然后让温度缓慢降到室温(约 30 min) 以使引物与随机寡核苷酸复性。
4. 加入 90 ul 5 mmol/L 4dNTP 混合物和 20 ul(100 U)Klenow 聚合酶,于 37℃ 孵 育 3 h。
5. 用苯酚/氯仿抽提反应混合物,乙醇沉淀 DNA。
6. 用 0.8 ml 水溶解 DNA 沉淀。
7. 加入 100 ul 10×Ava II 反应缓冲液和 100 ul (1000 U)Ava II。37℃ 孵育 4 h。
8. 重复步骤 5 操作。
9. 用 150 ul 10 mmol/L Tris·Cl, pH 8 溶解 DNA 沉淀,加入 50 ul 体积的非变性上样缓冲液。
10. 用预制的 10% 非变性聚丙烯酰胺胶电泳分离 DNA。
11. 用紫外照射定位 DNA 条带并切下该条带。
12. 将胶条浸泡于 DNA 洗脱缓冲液中振荡过夜以从胶中洗脱出 DNA。
13. 乙醇沉淀 DNA 并溶解于 200 ul 10 mmol/L Tris·Cl, pH 8 中。用紫外分光光度计测定 DNA 浓度,或用 EB 斑点定量估计 DNA 浓度。
14. 选择一种硫氧还蛋白表达载体(pJM),于 420 ul 无菌水中加入 12 ug 所选载体。
15. 加入 50 ul 10×Rsr II 反应缓冲液和 30 ul(60 U)Rsr II 酶 37℃ 孵育过夜。
16. 加入 10 ul (100U) CIP 并于 37℃ 孵育 1 h 以使 II 酶切过的 PJM 载体去磷酸化。 17. 用 PCR 纯化柱或苯酚/氯仿抽提纯化去磷酸化的、Rsr II 酶切过的 pJM 载体。
18. 将 8 ug DNA 片段(步骤 13 与 12 ug 载体(步骤 17)合并加入到水中至终体积为 860 ul。
19. 加入 100 ul 10×T4 DNA 连接酶反应缓冲液和 40 ul (80 000 U) T4 DNA 连接酶。 16℃ 孵育 16 h。
20. 用 QIAquick 胶回收试剂盒并按照厂家的操作说明纯化连接好的 DNA。用 30 ul 超纯水将 DNA 从柱上洗脱下来。
21. 冰上融化 350 ul 电转化感受态的 E.coli MC1061, 加入 300 纯化的连接质粒,混合后转入 0.2 cm 间隙电转杯中。
22. 用如下条件进行电转:2.5 kV,200 Ω, 25 uF 。
23. 加入 25 ml 预热的 SOC 培养基并于 37℃ 轻轻摇荡 1.5 h 使细胞复原。
24. 进行一系列稀释然后涂布含 50 ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板以确定转化效率。
25. 将剩余细胞转到 1 L LB 液体培养基中(含 50 ug/ml 氨苄青霉素)并于 37℃ 孵育过夜。
26. 用大规模质粒制备试剂盒或连续的溴化乙锭/CsCl 密度梯度离心纯化质粒 DNA。测定浓度并调整为 40 ug/ml 以用于筛选。 展开 |