实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | Taq 聚合酶10×缓冲液引物dATPdGTPdCTPdTTPMgCl2MnCl2完全极限(CM) 缺失成分培养基和平板Xgal 平板 |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 制备 PCR 预混合物(共 3.775 ml): 500 ul 10×Taq 聚合酶缓冲液 5 ul 1 mol/L MgCl2 10 ul 100 mmol/L dATP 10 ul 100 mmol/L dGTP 50 ul 100 mmol/L dCTP 50 ul 100 mmol/L dTTP 125 ul 20 umol/L 引物 1 125 ul 20 umol/L 引物 2 2.9 ml 水 2. 对每一个样品,加入下列试剂到 PCR 管中: 12 ul 水 1 ul 肽适配体表达载体 10 ul Mg2+/Mn2+ 溶液 76 ul PCR 预混合物 1 ul Taq 聚合酶(5 U) 3. 用下列 PCR 反应程序进行扩增反应: 4 个循环: 30 s 95℃ (变性) 1 min 55℃ (复性) 1 min 72℃ (延伸) 4. 移出 13 ul 反应混合液到一新的 PCR 管中,新管中预先吸入: 10 ul Mg2+/Mn2+溶液 76 ul PCR 预混合物 1 ul Taq 聚合酶 用同样的 PCR 程序扩增。 5. 重复总共 10 轮的扩增。 6. 用 PCR 纯化柱或琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR 产物。 7. 用 Ava II 消化纯化的 PCR 产物,然后按照标准的亚克隆技术将其亚克隆到经 II 酶切过的 PJM-I1中。 8. 用乙酸锂酵母转化法将 pBait 和 pBR1840 转入 EGY48 中。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上筛选转化株。 9. 用高效乙酸锂方法将 10~50 ug 突变的肽适配体库转化含 pBait 和 pBR1840 的 EGY48。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 平板上筛选转化株。 10. 收集转化株,测定平板效率。 11. 接种约 5 个库等价物到 1 ml Gal/Raf/CM-His、 -Ura、-Trp 液体培养基中。于 30℃ 振荡培养 4 h。 12. 室温下,于 3000 g 离心 4 min。弃上清,将酵母沉淀重悬于 1 ml 无菌水中。 13. 将酵母涂布到 15 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp, X-gal 平板上,于 30℃ 培养至克隆出现(约 2 天)。 14. 将蓝色克隆划线接种到一 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 主平板上并于 30℃ 培养 1 天。 15. 将主平板复印到 10 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、X-gal 平板和 Glu/ CM-His、 -Ura、-Trp、X-gal 平板上。 16. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并重新导入,含有 pBait 和 pBR1840 的酵母株 EGY48 中以再次验证表型。 17. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并对可变区进行测序。 |
注意事项 | |
其他 | 1. 材料 质粒 DNA:肽适配体质粒,pBait,pJM-1, pRB1840(1-LexAop-LacZ 报道质粒)和 pJK103 酵母株:EGY48 Mata ura3 trpl his3 3LexA-operator-leu2 2. 试剂 5 U/ul Taq 聚合酶和 10×缓冲液(Life Technologies) 1 mol/L MgCl2 100 mmol/L dATP 100 mmol/L dGTP 100 mmol/L dCTP 100 mmol/L dTTP 20 umol/L 引物 1: 5'-CCGCCGCCTGAATTCATGAGCGATAAAATTATTCAC-3' 20 umol/L 引物 2: 5'-CGGGGCGATCATTTTGCACGGACC-3' Mg2+/Mn2+ 溶液:45 mmol/L ,MgCl2 和 5 mmol/L MnCl2 PCR 纯化柱(可选;如 Qiagen) 完全极限(CM) 缺失成分培养基和平板,补加 2% (m/V) 葡萄糖 (Glu) 或 2% (m/V) 半乳糖和 1% im/V) 棉籽糖 (Gal/Raf): Glu/CM-His、-Ura (10 cm 平板) Glu/CM-His、-Ura、-Trp (10 cm 平板) Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp (液体培养基) Xgal 平板 Glu/CM-His, -Ura, -Trp, X-gal (10 cm 平板) Gal/Raf/CM-His, -Ura, -Trp, X-gal (10 cm 和 15 cm 平板) 3. 耗材 PCR 管 自动热循环器 30℃ 培养箱 |