动物细胞培养及外源基因导入的原理和操作步骤

实验概要

通过本实验掌握传代细胞培养的基本方法，了解无菌操作的基本原则。掌握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。了解细胞凋亡的形态特征，掌握细胞凋亡DNA梯度（“DNA Ladder”）电泳检测法。

实验原理

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、检测和记录。体外培养的细胞可采用显微镜，电镜等直接观察记录，充分满足实验的要求。另外还具有研究范围比较广泛，研究费用相对经济等优点。
然而，细胞培养也有其局限性。由于培养的细胞脱离了机体复杂的环境条件，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。尤其是体外反复传代、长期培养的细胞，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。因此，应将体外培养的细胞视为一种既保持动物体内原细胞一定的性状又具有某些改变的特定的细胞群体。
由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来细胞培养技术在分子生物学、细胞生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，其中对于分子生物学家及细胞生物学家而言，应用细胞培养对感兴趣的基因产物进行定位、运动及功能研究变得越来越重要。在克隆一个基因后的下一步，往往是将其导入不同类型细胞，以分析其表达，测定表达对细胞生长的影响，或将高表达的基因产物纯化。将外源DNA导入哺乳动物细胞有两种途径：稳定（永久）或暂时性转染。稳定转染的目的是将转移基因整合到细胞染色体DNA上，形成稳定表达转移基因的细胞系。一般需要共转染一个选择标记，用于追踪转染成功的细胞或转染效率。暂时性转染的目的是为了分析转移基因的暂时转录或表达，一般在转染后1-4天内进行。针对培养细胞的外源DNA导入已发展出多种技术，其中常用的有磷酸钙介导的转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染，电穿孔法等。这4种方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暂时性转染和永久性转染。但它们有各自适用的细胞系。培养的细胞不同，其在摄取和表达外源DNA的能力上可能存在几个数量级的差异。因此针对细胞系优化并比较几种不同方法的效率很重要。  
Graham和Vander EB（1973）首次报告了用Ca₃(PO₄)₂-DNA沉淀将腺病毒SV40导入哺乳动物细胞的方法，Wigler等（1978）证明这种方法也能用于导入并在哺乳动物染色体上稳定整合外源DNA。至今对于磷酸钙介导的DNA转染的确切机理仍不清楚。一般认为转移DNA通过内吞作用进入细胞质，然后进入细胞核，而CaPO₄处理被认为是产生了一种能促使DNA附着在细胞表面的环境。
细胞凋亡是细胞的一种基本生命现象，对于机体的组织发育、器官分化及多种病理过程均具有重要作用。细胞凋亡具有典型的形态学及生化特征。包括细胞膜皱缩，胞间连接减少，染色体凝集，细胞核崩解并形成凋亡小体等。其中一个强有力的生化指标是“DNA   Ladder”的产生，由于凋亡相关的特异核酸酶在凋亡过程中的激活，凋亡细胞的总DNA可以在核小体间进行切割，提取总DNA进行电泳可以形成间隔180-200bp的阶梯状电泳条带（DNA  Ladder）。一般认为出现DNA Ladder 的细胞肯定发生了凋亡，但并非所有发生凋亡的细胞都会出现DNA  Ladder。这种检测方法也受到灵敏性的限制，只有当凋亡细胞占到细胞总量的15%以上时，特异降解的DNA经过电泳才会较好地显示DNA  Ladder。
细胞凋亡的信号可能来自于细胞外部或细胞内部。其中死亡受体介导的凋亡途径（Death-receptor  Pathway）是细胞外部信号（细胞因子）诱导凋亡的主要方式。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体家族，其共同特征是具有一个同源的死亡结构域（Death  Domain，DD,）。当死亡受体的配体与之结合以后或死亡受体本身过量表达均可促使受体的死亡结构域的寡集化，形成死亡诱导信号复合物（DISC,  death-inducing signaling complex），DISC通过其它一些接头蛋白（adaptor  protein），活化凋亡特异性蛋白酶Caspase-8，从而启动凋亡的级联反应，产生包括“DNA  Ladder”在内的一系列生理特征。死亡受体中较为典型的是CD95（Fas）和TNF-R1。在本实验中，我们在293细胞中过量表达TNF-R1，诱导293细胞凋亡，观察凋亡细胞的形态并检测其“DNA  Ladder”。

主要试剂

1. 细胞营养液（DMEM液体培养基，10％胎牛血清，双抗100单位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO₄·2H₂O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ过滤除菌），CaCl₂（2.5M，0.2μ过滤除菌）溶液，超纯水（灭菌）。
3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，无水乙醇，酚/氯仿，DNA上样缓冲液，琼脂糖，TAE电泳缓冲液，EB。

主要设备

1. 250px细胞培养皿

2. 50ml、15ml一次性离心管

3. 10ml玻璃吸管（灭菌），与玻璃吸管配套的吸球及胶管

4. 二氧化碳培养箱

5. 倒置显微镜
6. 20μl，200μl微量移液器

7. 1.5ml离心管（灭菌）

8. 200μl微量移液器头

9. 1ml微量移液器

10. 低速台式离心机

11. 高速台式离心机

12. 4°C，－20°C冰箱

13. DNA凝胶电泳设备

14. 紫外凝胶成像仪

实验材料

胚肾细胞系293，TNF－R1哺乳动物细胞表达质粒（CsCl超速离心纯），哺乳动物细胞表达载体（CsCl超速离心纯）。

实验步骤

1. 293细胞的传代培养（第一天）
   1) 显微镜观察母细胞的生长状态，确定传代比例。
为了获得较高的转染效率，必需保证细胞处于合适的生长密度，因此应根据母细胞的生长密度调整传代比例。磷酸钙转染的合适细胞密度为50％－70%，本实验中使用的293细胞长成致密单层后一般按照1：6传代即可。
   2) 在酒精灯旁打开培养皿盖，倒去皿中的细胞营养液，加入2mlHank’s液，轻轻摇动，将溶液倒出。
   3) 消化与分装。
在培养皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA,   0.05%胰蛋白酶液），37°C静置5分钟左右，显微镜观察，如果细胞变圆且彼此分离表明消化完全，此时可加入10ml营养液终止消化，吹打数次，使培养皿壁上的细胞全部脱落下来，并分散形成均匀的细胞悬液。按照传代的比例补加适当体积的营养液，吹打混匀后分装到新的培养皿中。  
在分装好的细胞培养皿上做好标记，置于37°C二氧化碳培养箱中培养。
2. 用磷酸钙介导的外源质粒转染法在293细胞中过量表达TNF－R1（第二天）
   1) 显微镜观察待转染细胞的生长状态
      a. 观察细胞是否污染
      b. 观察培养液颜色的变化
      c. 观察细胞的生长密度
   2) 转染
      a. 用微量移液器在1.5ml离心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）质粒DNA（实验组为TNF-R1的哺乳动物细胞表达载体，对照组为空载体），350μl超纯水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混匀。
      b. 在另一1.5ml离心管中加入400μl2×HBS，将A液分三次缓慢加入，每次加入A液后用吹气泡的方法混匀。室温静置5分钟。
      c. 将A，B混合液均匀地滴加在待转染的293细胞培养液中，轻轻晃动使混匀。将培养皿置于37°C二氧化碳培养箱中。
3. 凋亡细胞的形态观察，“DNA Ladder”的提取及琼脂糖电泳分析（第三天）
   1) 显微镜观察过量表达TNF-R1（实验组）和空载体（对照组）的293细胞形态上的差异。
    2)  用10ml玻璃吸管将实验组和对照组培养皿中的细胞轻轻吹打下来，收集到15ml离心管中，2000rpm离心5分钟，沉淀用1mlPBS重悬，转移到1.5ml离心管中，2000rpm离心3分钟，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml  蛋白酶  K)，重悬细胞，再加入200μlPBS（2％NP40），颠倒混匀，4°C作用30分钟，期间颠倒数次。12,000rpm离心2分钟，吸出上清，加入1ml乙醇，颠倒混匀，－20°C静置10分钟，12,000rpm离心10分钟，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C静置20分钟。  
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上样缓冲液，取出50μl进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪拍照。