化学发光酶免疫法测定水产品中残留氯霉素

实验概要

实验利用化学发光酶免疫法测定了水产品中残留氯霉素。

实验原理

氯霉素(CAP)能抑制人体骨髓造血功能，引起人类再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿，早产儿灰色综合症等疾病。我国禁止在动物饲料中使用。免疫分析法操作简单，快速，通常用来大规模筛选样品。但目前常用的显色ELISA(cELISA)的检出限一般在0.1μg/L左右，而CAP的允许的最大残留量(MRL)也在0.1μg/L,并且MRL还有下调的趋势。因此cELISA方法难以达到检测要求。而本研究建立的化学发光酶免疫检测方法  (CLEIA)检测对虾组织中残留的CAP,检测灵敏度可达到0.01μg/L;检测范围为0.03～23.7μg/L,可满足CAP残留的检测要求。

主要试剂

1. 发光底物液SuperSignalλ(美国Hyclone2Pierce公司)

2. 抗CAP鼠单克隆抗体(Abcam公司)，免疫原为CAP2KLH。

3. CAP系列标准溶液:由国家进出口商品检验检疫研究所赠送，经HPLC测定的100μg/L标准储液系列稀释而成。

主要设备

1. LuminoskanAscent化学发光检测仪

2. 可调式移液器

3. 8×12可拆发光检测黑板(ThermoLabsystems公司)

实验步骤

1. 竞争CLEIA(competitiveCLEIA,CLEIA)方法检测CAP的建立　

   1) 0.2g/LCAP2BSA溶液，包被黑色检测板，50μL/孔，4℃过夜;

   2) 次日取出，回至室温，PBST洗涤3次，加入20g/L的BSA 溶液，100μL/孔，封闭，4℃过夜;

   3) 先加入0.0、0.01、0.05、……、31.25μg/L系列CAP标准溶液，20μL/孔，每个浓度重复5次，随后加入1mg/L的一抗，30μL/孔，剩下孔加入50μLPBST,作为空白对照，室温30min;

   4) 洗涤后，加入1∶4000稀释的 HRP2IgG,50μL/孔，室温30min;

    5) 加入发光底物，50μL/孔，LuminoskanAscent化学发光检测仪里面稳定2min,  测425nm光强度，检测时间1s。用四参数方程拟合标准曲线:LU/LU0=(A-D)/[1 (x/C)B]  D。其中LU/LU0为各标准浓度的光强度(lightunit,LU)与0标准浓度的LU的比值;x为标准液或分析物浓度，A和D分别为0标准液的LU和空白对照的LU,C为ED50点的浓度，B为ED50点处的斜率。

2. 精确性和准确性测定　

虾洗净后，去头、去壳，取虾仁为分析样品。取4支10mL玻璃匀浆器分别编号为1#、2#、  3#、4#。称虾仁5g于4支玻璃匀浆器中，分别加入8、7.95、7.9和7.6mL乙酸乙酯，并于匀浆器中分别加入100μg/LCAP标准储液0、   5、100和400μL,配成0μg/kg(阴性对照)、0.1μg/kg(低浓度)、2μg/kg(中浓度)和8μg/kg(高浓度)4个水平。匀浆30min,转移至15mL离心管中，匀浆器用2mL乙酸乙酯冲洗，与匀浆液合并，4000r/min室温离心10min。吸取上清液，在N₂流下干燥。2mL正己烷溶解干燥物后，加入1mLPBST,剧烈混匀后离心。沉淀用1mL正己烷溶解，离心后合并。每个浓度6次重复，分别计算批间(连续测定4d)和批内相对标准偏差及回收率。