实验概要
本实验利用葡聚糖凝胶柱层析对PPO粗酶液进行了纯化。
实验原理
1. 葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。(G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质)
2. 利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，(NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来)。粗酶液从而得到纯化。
主要试剂
1. 0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml；
2. NaCL；
3. 聚已二醇；
4. DEAE-纤维素DE52；
5. 葡聚糖凝胶SephadexG-200；
6. 兰葡萄糖-40、70、100等。
主要设备
1. 试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、试剂瓶、移液管、滴管等；
2. 层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机。
实验步骤
1. 葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
1) 柱材处理
称取一定量的SephadexG-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
2) 装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液(凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果)轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-50px处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
3) 平衡
利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝胶。
2. 上样：将粗酶液上柱。
3.洗脱：用0.02MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.001MEDTA)洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
4. DEAE-纤维素的处理及装柱
1) 处理
本实验采用的是DEAE-纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1-2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1-2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。
2) 装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-50px处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
3) 平衡
利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。
5. 上样：
将洗脱酶液上样，用0.02MTris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001MEDTA)洗脱杂蛋白。
6. 洗脱：
用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001MEDTA)进行梯度洗脱。
7. 测定酶活性和蛋白质浓度。
注意事项
1. 为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉。
2. 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。