酵母菌细胞融合实验

实验概要

学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定基础。

实验原理

酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术都有了突破性的进展。作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。这种经溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。

本实验以酿酒酵母为材料，进行原生质体的分离制备和再生。酵母菌原生质体的制备一般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。分离制备过程受许多因素的影响，如不同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。所以整个实验过程设计应综合考虑各种因素，才能获得较好的效果。分离制备的原生质体在适当的再生培养基上培养时，可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态，即完成再生过程，这也是以原生质体为受体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。

在原生质体制备中，应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。一般来说，对数生长期的酵母菌细胞易脱壁，静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。而不同菌种的生长对数期也略有差异，一般在12～16小时之间（10⁸细胞/ml）。制成的原生质体悬浮液在0℃条件下保存4～6小时，不会影响融合再生率。所以欲进行原生质体融合，应在制备后尽快进行，以免时间过长，影响再生。

分离过程中采用的β-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏，使蜗牛酶易于分解细胞壁。此外，渗透压的调节可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。

主要试剂

液体YEPD：1000 ml 分装四瓶（蛋白胨 2%  葡萄糖 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

高渗YEPDS：1000 ml (加入  KCl  52.5 g)  YEPD 液体培养基中加入2%琼脂

PB   2000ml                                                                                                                                                                                

柠檬酸：21克溶于1000毫升蒸馏水中   磷酸氢二钠：143.256克溶于2000毫升蒸馏水中 

        取柠檬酸溶液678毫升取磷酸氢二钠溶液1322毫升混合得2000毫升PB

高渗PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克

PEG-CaCl：聚乙二醇6000  40克加入至100毫升高渗PB溶液中使氯化钙为0.4mol/l

0.2%β-巯基乙醇，无菌过滤器过滤

蜗牛酶液：1.5% 蜗牛酶用高渗PB缓冲溶液配制，无菌过滤器过滤

淀粉YEPDS：1000 ml (加入  KCl  52.5 g)  YEPD 液体培养基中加入2%琼脂（蛋白胨 2%  淀粉 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

主要设备

恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。

实验材料

菌种：酿酒酵母SP-48、L-酵母。　

实验步骤

1. 原生质体的制备:
   1)    菌种培养:将酵母菌sp-48和L-酵母活化转接新鲜斜面.自新鲜斜面分别挑取一环sp-48酵母和L-酵母转接入250ml完全培养基中，30℃振荡培养16-18h；
   2)    收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液5ml，4000r/min离心10min，弃上清液.柠檬酸-磷酸缓冲液(PB)洗两次，收集菌体；
   3)    预处理：取5ml0.2%β-巯基乙醇PB缓冲液于装有酵母泥的离心管中，30℃保温10min，以1000转/分离心10min，倾去上清液；
    4)    脱壁：在装有处理过的SP－48，L-酵母菌泥的两只离心管中，分别加入5ml  1.5%蜗牛酶-PB溶液置30℃水浴中处理,取样镜检，当 80%以上的细胞转变为原生质体  2500r/min离心10min，用PB液离心洗涤，洗去酶液，加入4ml高渗PB液制成10⁶/ml以上的原生质体液，测定形成率。

原生质体形成率=(酶解前菌落计数-未形成原生质体菌数)/ 酶解前菌落计数×100%

2. 原生质体再生率测定 :

将制备的原生质体稀释到2-3×10⁷个/ml,各取1ml原生质体液用PB液稀释后涂布在高渗完全培养基（YEPDS）和完全培养基(YEPD)。30℃培养2天计算菌落数,酶解前的菌液直接用无菌水稀释涂布完全培养基，培养后计算菌数。

原生质体再生率％＝(再生平板得菌总数-未形成原生质体总数)/(酶解前总菌数-未形成原生质体总数)乘以100%
3. 原生质体的融合:
   1) 将L-酵母的原生质体用紫外线灭活2分钟，在黑暗中保存20分钟， 2500rad/min离心10min，用2ml高缓冲液悬浮；
   2) 将两菌的原生质体悬浮液混合，离心，向沉淀中加入3mlPEG-CaCl₂，振荡均匀，30℃处理20min, 镜检并观察融合情况；
   3) 用高深缓冲液洗涤菌体沉淀， 2500rad/min离心10min；
   4) 立即用高深缓冲液稀释，取融合原菌液及10^-1稀释液各0.1ml菌液，涂布于再生培养基平板上。

4. 融合子的检出:

将融合液涂布在加有0.01%的放线菌酮和青霉素(100IU/ml)的再生培养基上，30℃进行培养2天，计算融合率。   

融合率=融合子/完全培养基平板上再生原生质体数×100%

注意事项

整个分离制备和再生过程于无菌条件下操作。