染色体DNA的片段化

实验概要

琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺(PAGE)电泳是分离、鉴定和纯化DNA的标准方法。琼脂糖凝胶的分辨率比聚丙烯酰胺电泳低，但分离范围广，可以分离200 bp一50 kb的DNA。细胞凋亡时染色体从核小体间断裂形成大小为180-200bp整数倍的片段，在琼脂糖凝胶中电泳后可呈现出规则间隔180-200bp的特征性“梯形带”。

主要试剂

1. 细胞裂解液：10 mmol／L Tris-HCL(pH 8.0)，150mmol／LNaCl，10mmol／LEDTA，0.4％SDS，蛋白酶K 100ug／m1。

2. RNase(10 mg／m1)：RNase溶解于100 mmol／LTris-HCl(pH7.5)及15 mmol／L NaCl中。煮沸15 min后缓慢冷却至室温，-20℃储存。

3. TE缓冲液：Tris-HCl l0mmol／L(pH8.0)，1 mmol／LEDTA(pH8.0)。

4. 其他试剂：醋酸钠(pH5.2，3mol／L)、饱和酚、异戊醇、氯仿、无水乙醇等。

实验步骤

1. 细胞收集：常规离心收集1-5X10⁶细胞，注意因凋亡而悬浮的细胞和贴壁的细胞要同时收集。弃上清液，PBS洗1次。加入0．5m1细胞裂解液，在50℃中放置3-5h，以裂解细胞。

2. 在细胞裂解液中加入等体积饱和苯酚抽提，6 000r／min离心5min吸取上清液，再依次用等体积酚：氯仿(1：1)，氯仿：异戊醇(24：1)抽提，6 000r／min离心5min吸取上清液。

3. 加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，1／10体积醋酸钠(3mol／L，pH＝5.2)，-20℃15min，12 000r／min离心30min。

4. 弃上清液，70％乙醇洗1次。沉淀晾干后溶于100／ul TE缓冲液。

5. 加5／ul RNase，37℃水浴30mid。取20ul DNA混合缓冲液后上样，1％琼脂糖凝胶电泳(50V，1.5～2h)，UV下观察。