条件基因剔除转基因动物

实验概要

本文介绍了条件基因剔除转基因动物技术。条件基因剔除转基因动物技术把靶基因的灭活限定于特定时间和某一特定组织细胞内，这将使基因剔除技术具有更大的应用价值。

实验步骤

1. 条件基因剔除技术
   1) 重组酶
真核系统所广泛用的4种位点特异重组系统包括：
      a. P1噬菌体的Cre/LoxP；
      b. 啤酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)的2μ质粒的FLPFRT；
      c. 嗜盐杆菌Zygosaccharomyces rouxii的R-RS；
      d. Mu噬菌体的Gin-Gix。
   2) 位点专一性重组
      a. 在染色体的一个理想位置获得含有Cre重组酶识别位点的动物材料。有了这种材料，再转移任何其他基因时，整合和表达效率就会提高几十倍。
      b. 在YAC的环状功能域的适当位置插入Cre重组酶识别位点，通过位点专一性同源重组将目的基因装到YAC载体上。

2. Cre/LoxP重组酶系统
   1) Cre重组酶介导的DNA重排都仅仅需要整合酶和重组位点的存在，而不需要其他任 何细胞因子的辅助。
   2) LoxP都是由34bp构建的回文序列，是一个由8bp不对称的核心区分开的两个13bp的反向重复序列。
   3) 根据重组位点的方向和分子的数量，相应地导致DNA序列的缺失、重复、整合、倒位、易位。

3. 组织特异性基因剔除
   1) Flox-and-delete
      a. 重组发生在最外侧的两个LoxP之间(I型缺失)，标记基因和靶位点同时被切除；
      b. 重组发生在neo基因两侧的LoxP之间(Ⅱ型缺失)，标记基因被切除，而靶位点两侧仍然被LoxP锚定；
      c. 如果重组发生在靶位点两侧的LoxP之间(Ⅲ型缺失)，靶位点被切除而标记基因留下，这种结果没有用处。
   2) Flox-and-replace和flox-and-invert
      a. flox-and-replace的目的是用另一个基因或基因片段置换靶基因或片段，以考察在特异性组织或细胞中新的基因能否取代靶基因的功能。
      b. flox-and-invert是fiox-and-replace的一种变化，最大的区别是靶位点两侧的LoxP序列方向相反。靶位点序列最终都没有被删除但已经没有功能。
      c. 基于LoxP的倒位，invert优于replace之处在于不存在转录本通读的问题，因此，倒位可以应用在大的基因内部的外显子的置换。

4. 可诱导的组织特异性基因剔除
   1) Cre基因在不同发育阶段的表达诱导，可以时空二维的方式实现对靶基因更全面的调控。
要实现对Cre基因表达的调控，可以在转录或转录后水平进行。
   2) 四环素系统
      a. 将四环素阻遏蛋白(Tet R)的结构基因和单纯疱疹病毒的基因片段进行融合，构建成受组织特异性启动子调控并表达四环素转录激活蛋白(tTA)的载体；
      b. 含有四环素抗性操纵子(TetO)和巨细胞病毒（CMV）基本启动子调控的四环素应答元件
(TRE)则与Cre基因融合构建成第二个载体。
      c. 获得在某一组织特异性表达tTA和Cre的转基因小鼠。