拟南芥转基因植株PCs含量的测定

实验概要

本实验测定了转基因拟南芥总谷胱甘肽(GSH)含量、非蛋白巯基(NPT)含量。

主要试剂

200 uM CdSO₄，5% sulfosalicylic acid(含6. 3 mM diethylenetriaminepentaacetic acid <DTPA>)，Co-enzyme working solution，Substrate working solution (DTNB)，K₂HP0₄，DTNB (10 mM)

主要设备

研钵，匀浆器，高速离心机，紫外分光光度计

实验材料

转基因拟南芥幼苗

实验步骤

用200 uM CdSO₄处理盆栽25 days的转基因拟南芥幼苗(土壤中Cd的终浓度为12.2 mg/kg soil)，3 days后，分别称取拟南芥叶片0. 5 g，液氮研磨称粉末状，加入lml 5% sulfosalicylic acid(含6. 3 mM diethylenetriaminepentaacetic acid <DTPA>)。将匀浆4℃离心10 min X 12,000 g，收集上清分别用来检测总谷胱甘肽(GSH)含量和非蛋白巯基(NPT)含量。

总谷胱甘肽(GSH)含量的测定(按“Total Glutathione Quantification Kit"<DoJinDo Molecular Technologies，Inc.>)说明书进行：

1. 顺序加140 ul Co-enzyme working solution和20 ul enzyme working solution；

2. 30℃温育5 min；

3. 加20 ul样品液；

4. 30℃温育10 min；

5. 加20 ul Substrate working solution (DTNB)，室温静置10 min；

6. 于412 nm处测定吸光值，根据标准曲线确定GSH的含量。

NPT含量的测定：

1. 取样品液300 ul与630 ul K₂HP0₄和25 ul DTNB (10 mM)(DTNB=Ellman's reagent=5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸))

2. 混合，室温静置2 min后；

3. 于412 nm处测定吸光值；

4. 根据以下公式计算NPT的含量：

Abs(sample)=(Tot. Vol./sample vol.) x (Abs₄₁₂)

Sample Calculation：Ave. = Abs(sample)/13600=3.7 mM thiol

其中：Tot. Vo1=955 ul，sample vol=300 ul

PCs含量的计算：

PCs含量即NPT含量与GSH含量之间的差值。