拟南芥的转化

实验概要

本实验采用花浸泡法利用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥。

主要试剂

YEB液体培养基，LB培养基，0.1 M CaCl₂，0.05 M MgSO₄，花浸泡缓冲液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 )，Rif，Kan

主要设备

摇床，离心机，培养钵，温室，托盘，塑料薄膜

实验材料

已构建好的表达载体，拟南芥

实验步骤

1. 农杆菌感受态细胞的制备和转化

   1) 挑取GV1301单菌落于10 ml YEB或者LB液体培养基中，28℃振荡培养至对数晚期；

   2) 取0.5 ml菌液加入50 ml新鲜YEB或者LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600=0.5；

   3) 转移至50 ml离心管中，冰浴20 min；

   4) 转移至50 ml离心管中，冰浴20 min；

   5) 4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体；

   6) 沉淀用8 ml预冷的0.1 M CaCl₂和0.05 M MgSO₄重悬；

   7) 4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体；

   8) 取200 ul感受态细胞，加入0.5 ug质粒，轻轻混匀；

   9) 液氮冷冻50 s，冰上放置40 min，42℃热激90 s；

   10) 加入800 ul LB培养基，28℃恢复培养1 hr；

   11) 涂布适量的细胞于筛选培养基上，超净台吹干表层液体；

   12) 28℃培养两天。

2. 花浸泡法转化拟南芥

   1) 接种含有表达载体的农杆菌克隆于5ml YEB培养基(含100 ug/ml Rif，100 ug /ml Kan)中，28℃，200 rpm，振荡培养过夜；

   2) 按1：50的比例转接到200 ml YEB培养基中28℃，200 rpm培养5 hr；5000 X g，离心15 min，收集菌体；重悬于花浸泡缓冲液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 )，调OD₆₀₀至0. 8。

   3) 将拟南芥培养钵倒置于装有花浸泡缓冲液的合适大小的容器上，浸泡3-5min，取出培养钵倒置于托盘中，用塑料薄膜覆盖托盘，24 hr后取下薄膜，于温室中继续培养。