小鼠精原细胞的分离和纯化

【摘要】　目的　探讨小鼠精原细胞的分离纯化。　方法　用组合酶消化法制备7～8d小鼠的生殖细胞悬液；用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞。　结果　所获细胞悬液内活细胞、死细胞及细胞团的百分比分别为90.08%、9.92%及8.91%；平均每个睾丸可获得4.136×10⁵个细胞；精原细胞主要分布于位于27%～35%间的Percoll梯度中，其超微结构与7～8d小鼠睾丸切片内精原细胞的超微结构一致，经纯化后其纯度达68.76%。　结论　用组合酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的7～8d小鼠的精原细胞能满足体外培养的需要。
　　【关键词】　精原细胞；分离；小鼠
　　【中图分类号】　S865.1⁺30.1　【文献标识码】　A　【文章编号】　0529-1356(2000)03-235

SEPARATION AND PURIFICATION OF SPERMATOGONIA IN MOUSE

ZHANG Xue-ming, LAI Liang-xue, LI De-xue^?, LI Zi-yi, WEN Xing-hao，
DU Xi-ming, YUE Zhang-peng, WANG Yan-zhao
(Department of Histology and Embryology, Faculty of Animal Sciences and Technology,
Quarter-master University of PLA, Changchun　130062,China)

　　【Abstract】　Objective　　To study separation method of mouse spermatogonia by Percoll discontinue density gradient centrifugation. Methods　Combination of enzymatic digestion was used to prepare germ cell suspension of mouse at 7-8 days and Percoll discontinue density gradient centrifugation was used to isolate spermatogonia. Results　Percentage of living cells, dead cells,clumps in suspension was 90.08%, 9.92%, 8.91% respectively, and 4.136×10⁵ cells could be obtained from one testis in average. Spermatogonia were mainly distributed in Percoll gradient between 27%-35%. Their ultrastructure was consistent with that in testis sections of 7-8 day old mouse. Purity of spermatogonia was 68.76% after they were purified. Conclusion　Spermatogonia isolated from mouse at 7-8 days by combination of enzymatic digestion and Percoll discontinue density gradient centrifugation could satisfy the needs of culture.
　　【Key words】　Spermtogonia; Separation; Mouse

　　精原细胞的生理生化特性及其分裂增殖、分化、运动、衰老、死亡等项生命活动的调节机制的深入研究，精子发生机理的进一步阐明以及精原细胞异体、异种移植技术的实际应用，都迫切需要找到一种可行的方法将其分离纯化，以期得到较高产量和纯度的有活力的精原细胞，用于体外培养。资料表明，从成年啮齿类的睾丸分离粗线期及其后各发育阶段生精细胞的工作已取得可喜成绩，所获细胞的纯度已超过90%，产量达到10⁷个^［1］。但可用于体外培养的精原细胞的分离却一直进展不大。有些报道虽然纯度很高，产量却很低；另一些报道产量高但纯度低。1977年，Bellve等^［2］报道从生后8d小鼠睾丸中获得了纯度91%的A型精原细胞，产量达2×10⁷个。但使用的小鼠却多达60余只，耗费了大量的实验动物。我们的前期工作已表明，小鼠生后7～8d，其生精上皮内基本只有支持细胞和A型精原细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成^［3］。在体外，支持细胞总是先生殖细胞而贴壁。因此，本实验选用生后7～8d小鼠的睾丸，事先排除其他生精细胞的污染，用组合酶消化获得细胞悬液，经Percoll不连续密度梯度离心，再用选择性贴壁法纯化，获得了较高纯度的精原细胞，基本满足了体外培养的需要。

材料和方法

1.实验动物
　　昆明小白鼠由本校实验动物中心提供，按常规方法饲养管理。参照文献［3］取7～8d小鼠用于细胞分离。
2.主要试剂
　　胶原酶IV(Sigma)，透明质酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，D-MEM(Gibco)，新生牛血清(NBS，Gibco)，Percoll(Pharmacia),胎牛血清(FBS，Gibco)。
3.细胞的分离
　3.1　分离液的配制：按PBS∶Percoll=1∶9的比例把湿热灭菌后的Percoll原液配制成90%的Percoll溶液。用无钙、镁离子PBS，按表1所列方案配制Percoll各梯度溶液。

表1　Percoll密度梯度的浓度、组成及密度
Table 1　Concentration, components and
density of Percoll gradients

3.2　细胞悬液的制备：取7～8d雄性小鼠5～6只，颈椎脱臼法处死。无菌收集两侧睾丸，置于盛有PBS的小皿中。整个睾丸收集过程在0.5h内完成。用尖镊子仔细去除每个睾丸的脂肪垫、附睾及睾丸白膜，加入适量PBS(1～2ml)，吸管用力吹打，将曲细精管吹散。加入相当于组织体积10倍的含1g/L胶原酶的PBS后入温箱，在37℃、5%CO2条件下作用15min(期间晃动数次)。之后移入5ml的离心管，轻缓吹打1～2次，静置待曲细精管段沉降后轻轻吸除上清，再重复上述过程1次。加入含1.5g/L透明质酸酶和0.25%胰蛋白酶的PBS后入温箱，同样条件下作用5～10min，倒置显微镜下见曲细精管段软散，有的已消散成单细胞或小的细胞团即可。加入含10%NBS、1%青、链霉素的新鲜D-MEM培养液终止消化，移入离心管中，1 000r/min离心3min或静置5min，待软散的曲细精管及已解离的精原细胞沉降后，轻轻吸去上清。重新加入1.5ml新鲜培养基(D-MEM+7.5%NBS+7.5%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%青、链霉素+1%丙酮酸钠)，吹打8～10次，制成单细胞悬液。 　3.3　Percoll梯度的制备及离心：从已制备好的每级Percoll梯度液中各取1ml，按密度从大到小依次叠加到10ml离心管中。将待分离的细胞悬液置于梯度最上层，以1 400r/min离心20min［4］。 　3.4　细胞的洗涤及计数：用吸管将各梯度中形成的细胞带小心取出，移至事先标记好的5ml离心管中，各加入1.5ml PBS稀释Percoll，以1 000r/min的速度离心3min,弃上清，重新加入1.5ml新鲜培养液吹起。取出1滴制备好的细胞悬液，加入10μl 0.4%台盼蓝混匀，用红细胞计数板计算活细胞、死细胞、细胞团的数目和细胞总数(没有吹散的由2个以上细胞连在一起的细胞团只记1次)，调整细胞密度至3×105个／ml。 　3.5　细胞的接种和培养　参照文献［3］进行。 　3.6　精原细胞的纯化及其纯度评估：分离细胞接种后，定时观察贴壁情况。当见到混杂其中的睾丸体细胞开始贴壁时，小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的精原细胞连同培养液一起吸出，另行接种培养。待细胞贴壁后(大约培养12～24h)，弃去旧液，用PBS洗1～2次，加入新鲜培养液。任选3个视野，用计数器计每个视野中的细胞总数和精原细胞数(圆形的精原细胞附着在多突起的支持细胞上，呈链状、葡萄串状或以散在方式存在［3］)，然后分别计算均值±标准差(±s)。 4.电镜样品的制备 　　将新分离后位于27%～35% Percoll梯度间的细胞离心成团，弃去培养液，加入2ml 2.5%戊二醛，4℃下预固定24h；PBS清洗后转至1%的锇酸中后固定2h，逐级丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片，JEM-1 200EX　Ⅱ电镜观察(分布在19%～27%及35%～43%Percoll梯度间的细胞太少，没有制成电镜样品)。 5.统计学分析 　　表2用方差分析法(analysis of variance)、表4用χ2检验法(Chi-square test)对所得数据进行统计学处理。