拟南芥转化

实验概要

本实验以拟南芥为试材介绍了转化及筛选的过程。

主要试剂

1. 渗透培养基:(1L)

1/2xMurashige-Skoog

5%蔗糖

0. 5克MES

用KOH调至pH5. 7

再加:10微升lmg/ml的6-BA母液

200微升Silwet L-77

Top agar

0. 1%琼脂PNS或水溶液

2. 筛选培养基平板

1xMS salt，或1XPNS

pH5.8

0. 8%琼脂

卡那霉素30mg/l (Columbia，LanDsberg)，Nossen需50mg/l

3. 次氯酸钠溶液

活性氯5. 2%原液用无菌水临时稀释7%使用

实验步骤

1. 植物生长

    1) 建议在直径7厘米的培养杯里种5处，每处种几棵，萌发一周后，每处只留下一棵最好的苗。

    2) 将萌发的植物培养至茎高约3厘米时，去除其顶生花序。注意要避免伤及腋生花序。去除顶生花序将刺激腋生花序的生长。转化必须在去除顶生花序4天后进行。

    3) 转化前，将已授粉花以及果荚去除掉。并使土壤吸足水。

    4) 转化操作

    5) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液l0ml，在转化前一天，转入人瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0.D600当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心15分钟。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮十相应体积的渗透培养基里，使0.D600在0. 8左右。

    6) 用喷雾器将菌液均匀喷洒在待转化植株上，移入恒温室竖直培养。

    7) 培养3到4周后，收种子。放在干燥环境存放2周。

2. 转化子的筛选

    1) 筛选前一般都要消毒，先用70%乙醇浸泡2分钟，再用次氯酸钠溶液处理15分钟，在上述处理时要不停地悬浮种子，最后用无菌水洗四次。

    2) 处理后的种子用Top aga均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。低温4度春化2到3天，移入恒温室培养。根据植物筛选抗性不同，来判断萌发的幼苗是否是转化子，一般卡那霉素筛选能够直观的通过黄绿苗来判断，而且一般萌发后2-3天即可判断出来，而潮霉素抗性的转化子不能通过黄绿苗来判断，需要在萌发后5-7天通过幼苗的发育来判断。