蚜虫内共生菌菌胞的提取方法

实验概要

Percoll溶液不连续密度梯度离心法提取蚜虫的内共生菌菌胞。

实验原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H_２O)，粘度也很小，可形成高达1.3g／mL密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

主要试剂

1. 小牛血清

2. Percoll细胞分离液

3. 70%酒精

4. 0.85％NaCl

主要设备

1. 高速冷冻离心机(3K-30)

2. 4℃、-20℃冰箱

3. 奥林巴斯显微镜

4. 微量电动组织匀浆器

5. 长针头注射器

6. 40 µL孔径滤网

7. 1.5mL和10mL离心管

实验材料

蚜虫

实验步骤

1. 不同浓度Percoll溶液的制备：先用9份Percoll原液与1份8.5％NaCl混合达到生理性渗透压，获得Percoll母液，然后用生理溶液0.85％NaCl稀释到所需浓度。

2. 不连续密度梯度Percoll层的制备：先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3. 制备样品：蚜虫成虫采自温室。将吸取的虫体暂时浸于70%的酒精中，用灭菌双蒸水反复漂洗数次，分批置于1.5 mL离心管中，用微量电动组织匀浆器研磨成粗样，40 µL孔径滤网过滤，滤液用0.85％NaCl稀释成样品，然后置于Percoll液的上层。

4. 离心：分别采用不同的离心力，不同的离心时间，进行离心筛选。

5. 吸取菌胞样品：用长针头注射器逐层去除Percoll液，收集界面部位的细胞，获含有Percoll液的细胞，用0.85％NaCl溶液洗涤2次，定量PCR及显微镜检测。