酵母菌的鉴定

实验概要

了解鉴别酵母菌的实验方法。

鉴定酵母菌的分类。酵母菌的分类依据是根据它的形态特征、生理生化反应特征来确定的。在分类前将菌体细胞进行分离纯化，得到由单细胞长成的菌落，然后再进行形态特征和生理生化鉴定。

实验原理

微生物学的类别分门、纲、目、科、属、种，生产酒精用酵母菌属于微生物中的真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。

(一)形态特征的鉴定

把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上，让它长成菌落，观察其菌落的形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。把它再接种到液体麦芽汁培养基中，观察是否能产生醭、试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环，培养液中是否产生沉淀、混浊程度等。另外，还要取样在显微镜下观察其单细胞的形态、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。

(二)生理生化特征的鉴定

酵母菌的生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类的能力。同时，还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸盐还是硫酸盐，发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等的能力。

最后，根据以上得出的形态特征和生理生化特征，查阅有关资料，把具有相同特征的一类酵母菌，就可以归属于某一属。

一、酵母菌糖发酵试验

酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。

酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝（pH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。产气可由发酵管气泡的产生予以证实。

二、酵母菌碳源同化试验

碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。

三、酵母菌氮源同化试验

酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故酵母菌对复杂的蛋白质不能利用，酵母菌对一些较简单的含氮化合物的利用程度也不一致。 

四、酵母菌生长曲线的测定试验

酵母菌属于单细胞真核型微生物，把一定数量的酵母菌接种于的液体培养基中，在适宜的温度下培养时，它的生长过程具有一定的规律性。在其生长过程中，定时取样测定酵母菌细胞数量，然后以酵母菌细胞数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制所得的曲线叫生长曲线。此生长曲线大致可划分为四个阶段：调整期、对数生长期、稳定期和衰退期。 

主要试剂

1. 酵母菌糖发酵试验
糖发酵基础液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。 

2. 酵母菌碳源同化试验 

实验材料

1. 酵母菌糖发酵试验
糖发酵基础液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。

2. 酵母菌碳源同化试验   

无碳基础培养基，啤酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖溶液。

3. 酵母菌氮源同化试验 
无氮基础培养基，啤酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和尿素溶液。

4. 酵母菌生长曲线的测定试验 
酵母菌增殖培养基，苹果酒酵母斜面菌种。 

实验步骤

一、酵母菌糖发酵试验

1)   糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中（培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.4×2.0－2.5厘米）一支。每种糖设三个重复管，<121℃>高压灭菌15分钟。

2)   将酵母分别接入上述各发酵管中，置<30℃>下培养48-72小时，另以不接种者作对照

3)   如产酸则培养液pH值下降而变黄色；如产气，则必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。

4)   结果记录。以“ ”表示产酸，“<0”>表示产气，“＋”表示产酸产气，“－”表示无变化，“碱”表示产碱。 

二、酵母菌碳源同化试验

生长图谱法

1)   无碳培养基内加入2%的水洗琼脂，融化后冷却至45<-50℃>，到至平板。

2)   接种新鲜培养的啤酒酵母于1毫升无菌生理盐水内，搅匀后倒入上述未凝平板内，摇匀待凝。

3)   皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源的标记。

4)   用不锈钢匙，按标记加入相应的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作对照。

5)   <28℃>下培养24-48小时后观察结果。

三、酵母菌氮源同化试验  

1、液体试管法

方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白对照。

2、生长图谱法

方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白对照。

3、结果观察

1）液体试管中溶液pH值的变化。

2）生长图谱中测量形成菌落的大小，说明对各种氮源的利用情况。

四、酵母菌生长曲线的测定试验 

1、将培养24小时左右的酵母斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，以3000转/分的速率离心，得菌体。将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗2-3次后，制备酵母菌悬液（细胞数量约106左右/毫升），测数备用。

2、取上述菌悬液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培养液的试管中，<25℃>下培养，以此为起始时间，记录起始溶液的细胞数。并在培养1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小时时分别取样检测酵母菌细胞数量。

3、酵母菌细胞数量的检测

方法①：活菌计数法。此法是将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，取一定量体积（在0.1-1毫升之间）的稀释液涂布于盛有固体培养基的培养皿内，在<25℃>下培养24小时左右，计算培养皿内菌落数就可测出溶液中活菌数量。

方法②：血球计数板计数法。此法是先将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，使菌落数约为105-106个/毫升，取一滴稀释液滴于血球计数板内，在显微镜下直接计算细胞总数。

4、绘制生长曲线

 以酵母菌细胞数的对数作为纵坐标，以培养时间作为横坐标，画出酵母菌的生长曲线。并分析酵母菌群体的生长规律。

附表1 酵母菌分属鉴定结果

附表2酵母种的鉴定结果记录