人类X染色质的观察

实验概要

掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件。

实验原理

1、X染色质的发现

1949年，加拿大学者Barr等人在猫的神经元细胞核中首次在雌猫体内发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫中则没有这种结构。进一步研究发现，除猫外，其他雌性哺乳动物（包括人类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构。称之为巴氏小体，也称为X染色质。
 

 正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深，大小约为1微米的三角形或椭圆形小体，即X染色质。间期核内X染色质的数目总是比X染色体的数目少1。正常女性有两条X染色体，因此只有一个X染色质；若有三条X染色体，就会有两个X染色质，余此类推。正常男性只有一条X染色体，所以没有X染色质。
 

2、莱昂假说（Lyon hypothesis）

为什么正常男女之间的X染色质存在差异？女性两个X染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，为什么不比只有一个X染色体半合子男性的相应基因产物多？为什么某一X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？1961年，Mary Lyon 提出了X染色体失活的假说，即Lyon假说对这些问题进行了解释。其实验依据是对小鼠X连锁的毛色基因的遗传学观察。发现雌性小鼠毛色杂合体不表现显性性状，也不是中间类型，而是显性隐性两种颜色嵌合组成斑点状（不是共显性）。而雄性小鼠却从不表现斑点状毛色，而是显性或隐性单一颜色的毛色。

Lyon假说的要点如下：

（1）雌性哺乳动物体细胞内仅有一条X染色体是有活性的。另一条X染色体在遗传上是失活的，在间期细胞核中螺旋化而呈异固缩为X染色质。

（2）X染色体的失活是随机的。异固缩的X染色体可以来自父方或来自母方。但是，一旦某一特定的细胞内的一个X染色体失活，那么此细胞而增殖的所有子代细胞 也总是这一个X染色体失活，即原来是父源的X染色体失活，则其子女细胞中失活的X染色体也是父源的。因此，失活是随机的，但是，是恒定的。

（3）X染色体失活发生在胚胎早期，大约在妊娠的第16天。在此以前的所有细胞中的X染色体都是有活性的。 

3、剂量补偿：

细胞内的X染色体数目超过两条时，仍只有一条保持活性，其余的都形成异固缩的X染色质。正常男性只有一条X染色体，所以X染色质的数目为0。45，XO 性腺发育不全的患者虽然是女性，但是因为只有一条X染色体，所以细胞内无X染色质。一个细胞中所含的X染色质的数目等于X染色体数目减一。

剂量补偿：由于雌性细胞中的两个X染色体中的一个发生异固缩（也称为Lyon化现象），失去活性，这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。这种效应称为X染色体的剂量补偿。
 

需要指出的是，失活的X染色体上基因并非都失去了活性，有一部分基因仍保持一定活性，因此X染色体数目异常的个体在表型上有别于正常个体，出现多种异常的临床证状。如47，XXY的个体不同于46，XY的个体；47，XXX的个体不同于 46，XX的个体，而且X染色体越多时，表型的异常更严重。

主要试剂

60%冰醋酸、45%冰醋酸、改良苯酚品红    

主要设备

显微镜、灭菌玻璃片、酒精棉球

实验材料

口腔颊部粘膜细胞；带毛囊头发

实验步骤

1、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察

    刮取颊部粘膜上皮细胞（用灭菌玻璃片）→涂片（两片45°角）→60%冰醋酸固定5分钟→吸去冰醋酸，用改良苯酚品红染色1-2分钟→压片→镜检

2、发根细胞巴氏小体观察

拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离5分钟→剥取毛囊→染色2-3分钟→压片观察
 

在女性间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核膜较远或接近核中央部位）。
 

正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。

注意事项

1．刮口腔上皮前要漱口；

2．刮时用灭菌玻璃片的宽边，勿用一角，以免划破口腔；

3．第一次刮下的脱落细胞用酒精棉球擦去，在原位重复刮一下制片；

4．盛放酒精棉球的小广口瓶，瓶盖用完即时盖好；

5．涂片略干再加改良苯酚口红；

6．染色时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分；

7．毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离；

8．可数细胞的标准：核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质。