结核杆菌的耐药机制及分子生物学检测方法进展

滕凤猛 陈昌杰（蚌埠医学院临床检验诊断中心，蚌埠 233030） 

 【摘要】 耐药结核病是当今全球结核病控制领域中的迫切课题，由于在结核病的治疗中忽视了治疗的管理，加之20世纪80年代以来，又受到HIV/AIDS感染流行的影响，结核菌耐药性与耐药结核病逐渐增多，甚至不少国家与地区发生多耐药结核病的暴发流行，因此进行结核分支杆菌的耐药性机制和检测研究，对有效的防治结核病，尤其是指导临床用药上，具有极其重要的意义。 
【关键词】 结核分支杆菌；耐药性机制

Development of mechanisms and detection methods in molecular biology of drug-resistent mycobacterium tuberculosis TENG Fengmeng，CHEN Changjie. Bangbu Medicine college，Bangbu 233030，China

【Abstract】 Nowdays drug resistant tuberculosis is a exigent problem of control for Tuberculosis. Because it had been ignored that supervise in the tuberculosis therapy and the influence of HIV/AIDS since 1981s , Mycobacterium tuberculosis and drug resistance tuberculosis occur more and more , even multidrug resistant tuberculosis break out prevail over many country and area, therefore study on molecular mechanisms and rapid detection methods of drug resistant mycobacterium tuberculosis is especially important for effective tuberculosis treatment and instructing clinical medication .

【Key words】 Mycobacterium Tuberculosis ；Drug Resistance Mechanism

       结核病困扰人类已有上千年的历史，至今仍是严重的公共问题。全世界因结核病而死亡的人数比所有传染病死亡的总和还要多，耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis, MDR-TB）则有可能使结核病再度成为“不治之症”，艾滋病的流行更是加剧了全球结核病的流行。因此，对结核病耐药机制的检测研究，尤其是对结核病耐药快速检测方法的研究已成为迫切的需要。

1 耐药结核杆菌的耐药机制

结核杆菌产生耐药性主要是由不合理用药引起的结核杆菌内抗结核药物作用靶基因突变所致[1]，结核杆菌发生耐药的机制目前从细胞机制与分子机制或细胞水平与分子水平上来分析。

1．1 细胞水平上的耐药机制　

①结核杆菌对抗结核药物的耐药概率不同，从而说明细菌对疗效最差的药物最易发生耐药。②抗结核药物防止耐药的效力不同。③病灶中细菌数量、药物应用数与耐药发生率的关系；病灶中结核杆菌数量越大，耐药的机会越多；用药数越多，耐药的机会越少。④优势学说和顺次选择学说，顺次选择学说是造成MDR的主要原因，也是造成MDR－TB的主要原因[2]。

1．2 分子水平上的耐药机制

迄今为止，关于结核分支杆菌耐药性机制问题有3种观点：①细胞膜(壁) 结构与组成发生变化，使细胞膜通透性改变，药物通透性降低，产生降解或灭活酶类，改变药物作用靶位。②质粒或转座子介导的耐药性，但结核分支杆菌是否存在质粒尚未得到确切的证据。③染色体突变介导的耐药，药物靶编码基因突变。近年国内外研究报告指出，耐药结核分支杆菌临床分离株药物靶编码基因发生突变，与耐药性密切相关，是结核分支杆菌耐药性的主要分子机制[2]。Jungblut等[3]采用2-DE和质谱技术，检测出了与异烟肼抗药性有关的蛋白。国内乐军等[4]采用2-DE及MALD I技术对异烟肼耐药的结核分支杆菌和敏感菌株进行比较蛋白质组学研究，发现了存在于耐药菌株的26个细胞壁蛋白，并鉴定了其中6个蛋白，推测可能是海藻糖-6-磷酸磷酸酶( putative treha-lose-6-phosphate phosphatase ) 、铁钼蛋白(moaA) 、莽草酸5-脱氢酶(putative shikimate-5-dehydrogenase) 、葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶( glucosamine-fructose-6-phosphate aminotrans-ferase) 、吲哚-3-甘油磷酸合成酶( indole-3-glycerolphosphate synthase) 、TetR 家族转录调节因子(putative-TetR-family transcriptional regulator) 。这6种蛋白质可能在结核分支杆菌细胞壁的合成以及细胞壁的新陈代谢中发挥重要作用，它们的发现为设计和开发新的抗结核药提供了重要信息。

1．3 蛋白质组学在结核病早期诊断研究中的应用z

结核病是结核分支杆菌引起的呼吸系统的主要传染性疾病，其病原学诊断主要依靠痰细菌涂片及细菌培养，但前者阳性率低，后者又需历时4～8周，耗时长。近几年出现的基因快速诊断，又因费用较高，实验室条件要求高，不易广泛开展。因而急需寻找快速、有效的早期诊断方法。Bahk等[5]对H37Rv以及临床分离的结核分支杆菌K株和CDC1551进行比较蛋白质组学研究，发现了8 种蛋白质：Rv0652、Rv1636、Rv2818c、Rv3369、Rv0566c、Rv3865、MT3304、Rv3160。这8种蛋白质在结核分支杆菌K株中含量相对较多。采用大肠杆菌分子克隆、表达、纯化的方法得到rRv0566c、rRv3369、rRv3874，联合酶联免疫吸附实验，对100 份肺结核患者和100份健康人血清进行研究，结果显示rRv0566c、rRv3369、rRv3874 诊断肺结核的敏感度分别是60%、74%、43%，特异度分别是96%、97%、84%。表明rRv3369和rRv3874有望成为肺结核早期诊断的分子标志物。

1．4 几种主要抗结核药的耐药分子机制　

1．4．1 异烟肼　近几年来的研究表明，过氧化氢酶——氧化物酶(catalase-peoxidase) 的编码基因(Kat G)和(或)参与分支菌酸生物合成的烯酰基还原酶编码基因(inhA) 改变，是结核杆菌耐异烟肼产生的主要分子机制，但这两种基因突变只能解释约80 %的耐异烟肼分离株，ahpC基因在另外20 %的耐异烟肼作用仍在研究中[6]。最近，Mdluli等发现β2酰酮酰基载体蛋白合成酶(kasa ,β-ketoacylacyl carrier protein synthetase) 上出现了引起氨基酸改变的突变，仅发生于没有以上基因突变的异烟肼耐药菌中[7]。

1．4．2 利福平　目前研究表明，结核分支杆菌耐利福平是由于其作用靶分子RNA多聚酶β亚单位的编码基因(rpoB)突变所致。且突变均发生在rpoB 509～533位的25个氨基酸的(75 bp)组成的区域内，突变频率最高的是在氨基酸密码子531（丝氨酸→亮氨酸）上，其次为526（组氨酸→酪氨酸）。对RFP敏感的菌株目前尚未发现存在rpoB基因的突变，而耐药菌株的突变检出率确在90%以上。Kapur等[8]和Morris[9]分析的结核分支杆菌耐药分离株来自欧洲、非洲、拉丁美洲和亚洲等11 个国家，所检测的药物靶基因及突变均无明显的地理差异，说明结核分支杆菌基因组稳定，进化变异缓慢。因此，了解rpoB突变分布频率有助于鉴定来自不同地理位置的耐药株。也有研究提出将检测rpoB基因突变作为MDR诊断的代表性标志。

1．4．3 链霉素　耐链霉素的结核分支杆菌编码核糖体的16SrRNA的rrS基因与核糖体蛋白S12rpsL基因发生突变，抑制药物结合到核糖体上的能力，影响16SrRNA的高顺序结构，使之对链霉素耐药[10，11]。链霉素主要作用于结核分支杆菌的核糖体，诱导遗传密码的错读，抑制mRNA转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合成。核糖体蛋白S12的正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准确性，rpsL基因突变会导致S12蛋白改变，而严格要求核糖体只使用与每一密码对应的氨酰2tRNA上的每一密码，抑制了与诱导的遗传密码错读而产生耐药性。虽然新近研究表明，16SrRNA基因(rrS) 突变也会导致部分结核分支杆菌产生链霉素耐药[12]，但rpsL基因突变是链霉素耐药的主要的分子机制。

1．4．4 吡嗪酰胺　目前认为吡嗪酰胺(PZA)在细胞内的酸性环境中经吡嗪酰胺酶作用转变成吡嗪酸而起杀菌作用。72 %的PZA耐药菌株编码吡嗪酰胺酶的pncA基因突变，核苷酸丢失或氨基酸替换，使酶活性丢失导致耐药。另28 %的PZA耐药菌的耐药机制仍在研究中。Sreevatsan发现，一旦结核分支杆菌对异烟肼、利福平、链霉素耐药时，很可能出现PZA耐药[13]。

1．4．5 乙胺丁醇　乙胺丁醇（EMB）可抑制[-214C]葡萄糖转入阿拉伯半乳糖的D－阿拉伯酸，并抑制阿拉伯半乳糖转入分支杆菌细胞壁，引起trehalose mono2和dimycolates的堆积。70 %EMB耐药菌株编码葡萄糖合成转移酶的embB基因突变，氨基酸替换可改变药物－蛋白质的相互作用导致耐药；另外30 %EMB耐药菌株可能与embB蛋白过分表达有关[10，14]。

1．4．6 喹诺酮类药物　耐喹诺酮与编码DNA螺旋酶(gyrase)亚单位的结构基因突变有关。突变集中在gyrA基因的保守区，87个密码子发生G→C突变，氨基酸置换。gyrA基因突变出现中、高度耐药，gyrB基因突变，呈现低度耐药[10]。这个区域内碱基的突变导致了菌体解旋解A亚基与氟喹诺酮类药物结合区结构改变，抑制了两者结合而导致耐药。 (责任编辑：admin)