基因组文库法
一）基因组DNA分离、纯化和加工
[Mbo I酶检测]
1．准备1.5ml小试管4个；每管内含有：
基因组DNA（在TE或水中） 10.0μg
10×Mbo I缓冲液 2.5μl
H2O 12.0μl
2．向每管中分别加入：0.1，0.5，1或2单位的Mbo I酶。
3．37℃保温到5，10，20，40分钟后，分别从每管中移出6μl，在干冰中贮存到下一步时一并使用。
4．把16个样品在琼脂糖凝胶中进行电泳，并与标准分子量进行比较。
5．选择参数为：能产生平均大小约20kb的时间和Mbo I的浓度。
[Mbo I酶切]
1．根据上述酶切检测结果，选用最佳酶切条件，并把酶的量加大100倍，用以消化1mg的基因组DNA；取1个10~15ml的塑料管，加入：
含1mg基因组DNA 1.0ml
Mbo I 按所测定的量加
10×Mbo I缓冲液 250.0μl
H2O 1.2ml
按前述（5）中所测定出的时间（产生20kb）于37℃保温。
2．用2.5ml 1：1酚和氯仿混合物抽提DNA.
3．把上层水相移入一新管中，加275μl 5M的NaCl。
4．加7ml乙醇，置冰水浴中沉淀10分钟。
5．4℃，12 000g离心10分钟。
6．倒除乙醇，重悬DNA于500μl TE缓冲液中，重悬过程在4℃中需数小时。
7．为获得大小合适的DNA片段，将步骤6中的DNA分作6分（每分约80μl），分别放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超离心管中，各通过蔗糖梯度密度仪。在含10~40%的蔗糖，20 mM Tris（pH7.4），10mM EDTA，1M NaCl等浓度中形成线性梯度。
8．135 000g 20℃离心16小时。
次日
9．用粗针头在每一管的底部刺一小孔（依次收集6管中的DNA）每管按12滴（350~500μl）作为一分收集入a, b, c…数管中，然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。
10． 从每分中都取10μl样品加10μl水稀释、4μl载样缓冲液、用0.4%琼脂糖凝胶电泳，然后与Hind Ⅲ酶切的λDNA标准分子量作比较，以确定那一分中所含片段为10~20kb大小。
11． 将含有16~20kb片段的管子并在一起，加2.5倍体积的乙醇，-20℃冷冻数小时。
第三天
12．10 000g 4℃离心10分钟，收集DNA。
13．弃上清液，重悬于160μl TE缓冲液中。
14．对大小合适的片段（16~20kb）再按8~13重复梯度分离，但此次只用两个管子即可；每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分离后，将沉淀的DNA悬浮在50μl TE缓冲液中。
第四天
15．取2.5μl样品（用溴化乙锭染色），与已知浓度和片段大小的DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳后，比较两者染色强度，估算出DNA浓度，并确证所制备出插入片段的不同大小。
16．把样品DNA浓度调到0.25μl/ml，-20℃贮存备用。
二）用于基因克隆载体DNA（噬菌体DNA）的制备
1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA，加：
EBML3 DNA(500μg) 500μl
10×BamH I缓冲液 100μl
BamH I (10U/μl) 100μl
H2O 300μl
2. 于37℃保温2小时。
3. 每管中加1体积（500μl）SS-酚和氯仿（1：1）混合物。充分混匀，于微型离心机中离心2分钟以分离两相，吸取上清水相至新管。
4. 在每管中加500μl氯仿，充分混匀，离心2分钟，分相。
5. 吸水相转入新管。
6. 在各试管中加50μl 5M NaCl，再加1ml乙醇。冰水浴中冷却10分钟。
7. 在微型离心机中4℃离心5分钟。
8. 弃去上清液，加1ml 80%乙醇洗涤沉淀物，离心弃去液体。
9. DNA沉淀物真空干燥。
10. 用500μl TE缓冲液溶解沉淀物。
11. EcoR I酶切EBML3 DNA，加：
从步骤10中所获DNA 500μl
10×EcoR I缓冲液 100μl
EcoR I (1 000U) 100μl
H2O 300μl
12. 于37℃保温4小时。
13. 按3-9抽提、沉淀并回收。
14. 用500μl TE缓冲液溶解沉淀物。
15. 异丙醇沉淀：在步骤14中得到的500μl DNA于1.5ml离心管中加：3M 醋酸钠（pH6.0）75μl，异丙醇（在1.5ml微型离心管中）300μl。
16. 冰水浴中置15分钟。
17. 在微型离心机中4℃离心10分钟。
18. 弃上清液，用200μl 0.35M醋酸钠和乙醇（1：2.5）溶液洗涤沉淀物。
19. 在微型离心机中4℃离心10分钟。
20. 重复步骤18和19。
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