大鼠尿微量白蛋白(ALB)酶联免疫吸附测定试剂盒
使用说明书
本试剂盒仅供体外研究使用!
预期应用
ELISA法定量测定大鼠尿液或其它相关生物液体中ALB含量。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗 ALB抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗 ALB抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物 TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 ALB呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度( OD值),计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板:一块(96孔)
2. 标准品(冻干品): 2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 ug/ml,做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后,分别稀释成200 ug/ml,100 ug/ml,50 ug/ml,25 ug/ml,12.5 ug/ml,6.25 ug/ml,3.12 ug/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 ug/ml,临用前15分钟内配制。如配制 100 ug/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 200 ug/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液:1×20ml。
4. 检测稀释液A:1×10ml。
5. 检测稀释液B:1×10ml。
6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
11. 覆膜:5张
12. 使用说明书:1份
自备物品
1. 酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)
2. 微量加液器及吸头,EP管
3. 蒸馏水或去离子水,全新滤纸
标本的采集及保存
1. 尿液:请收集清晨第一次尿液(中段尿),或24小时尿液,2000 x g离心15分钟后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。
2. 其它生物标本:请1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;
操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试 剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加 检测溶液A工作液 100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止