免疫荧光三标实验如何做？如何选择二抗？

免疫荧光三标？——蓝色荧光的AMCA与Dylight 405标记二抗

做免疫荧光实验中，经常要进行免疫荧光的双标记实验，也就是在同一个样本上同时进行两种蛋白的免疫荧光检测。具体的实验时，可以选择不同来源的一抗，然后再选择分别针对一抗的二抗，同时二抗上标记有不同的荧光团。一般的双标记实验里，都会选择一个绿色的（如FITC、Cy2、Dylight 488等）荧光标记，一个红色的（如Rhodamin、Cy3、TRITC、Texas Rad、Dylight 539等）的荧光标记。红绿二色的区分度很大，效果也比较理想。那么，如果是三标呢？请看看下面的一个图。

   左侧的一个免疫荧光图片就包括了3种颜色，绿色FITC（FITC最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光）和红色罗丹明Rhodamin（最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光）的荧光均为荧光团标记的二抗，而第三种颜色则来自于负染细胞核的蓝色DAPI染料（DAPI 的激发光波长为358 nm ,发射光波长为461 nm ,荧光激发下发蓝光，与细胞核DNA结合）。一般来说，绿色和红色荧光重合后显示的是黄色，而橙色、黄色、红色的光非常接近，因此三标的时候，一般选择蓝色荧光。就如左图所示。

   实际上，上面的示例并不是完全意义上的免疫荧光三标，因为DAPI只相当于负染。还有一种情况，需要同时在一个样本里通过免疫荧光技术对三种蛋白进行定位，这就需要选择第三种荧光团，而不是DAPI这样的染料。也即，一个绿色荧光标记的二抗、一个红色荧光标记的二抗，再加一个蓝色荧光标记的二抗。艾美捷为您提供两种蓝色荧光标记的抗体产品，一种是AMCA蓝色荧光，还有一种是具有更高荧光强度、更好光学稳定性和敏感度的Dylight 405蓝色荧光。

右图所示即为AMCA蓝色荧光与FITC、Cy3等荧光的对比图例。AMCA蓝色荧光团的吸收光波长最大为350nm，发射荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用*灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。艾美捷提供EarthOx 多种蓝色AMCA荧光标记的二抗，部分产品如下：

同时，Dylight 405作为Dylight系列的荧光团，具有很多优势，包括更高的荧光强度、更好的光学稳定性和特异性、更高的性价比等。具体见荧光二抗的选择——Dylight荧光与传统荧光标记的比较。EarthOx的部分Dylight 405荧光抗体产品如下：

作为多家国际知名品牌的中国或区域代理，艾美捷能为您提供全系列的Dylight原装进口荧光二抗，包括Jackson、KPL的大包装粉末形式的 Dylight荧光二抗，另外，也提供EarthOx的小包装液体形式Dylight荧光二抗，均具有很高的性价比。针对荧光标记二抗，有FITC、 TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二抗；按照检测物种分，有抗 人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、 IgG（ab’）2等不同类型抗体。