石蜡包埋组织的DNA提取及其应用

近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。

　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节　不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节　重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。

　　一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法

　　从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。

表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤

表18-6 TE9 DNA提取液的制备

5μm组织切片

↓

常规脱蜡、水化

↓

第一次溶液A孵育（去上清）

↓

第二次溶液A孵育（留上清）

↓

氯仿-异戊醇抽提

↓

RNA酶和蛋白酶消化

↓

酚抽提

↓

沉淀

↓

（却除未螺旋化DNA）↓

透析

图18-6　石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等，1986）

溶液A

　　不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb），因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。

　　二、影响DNA提取质量的因素

　　1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Warford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。

　　bramwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）处理标本不能获得完整的DNA。

　　乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm³乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本（19.4μg/mm³）。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带，说明DNA被完成消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。

　　Sato 等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无损。其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至-20℃过夜。然而再用丙酮分别在4^℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2～3h，石蜡包埋。结果显示，每10mg AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4±13.76μg）。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。

　　2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而，Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30%，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110之内。

　　3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节　，其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90^℃时，产生两条单链分子。在此变性状态下，甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。

　　最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。

　　酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变。当pH达到2.5以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N-糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最后，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而，即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。

　　4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之间，主要分布于100～1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的时间长短不一。虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。

　　组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA变性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。

　　三、提高DNA提取质量的方法

　　1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。

　　2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们从不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化时间和DNA纯化等问题上取得了进展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DAN与蛋白质不易分离。因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可达1mg/ml；作用时间一般为2～4天，最长可达7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba等发现，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能够得到令人满意的完整DNA。尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2-巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2-巯基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得高质量DNA。②DNA释放率对于不同的组织类型是有差异的，取决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏），通过24h孵育80%以上DNA可释放出来；相同量的DNA释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质，DNA释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织DNA提取，蛋白酶K的孵育时间可作适当调整，以求最大量地获取大分子DNA。此外，对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。③Dubeau等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的DNA，可通过搅起完整的DNA而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在DNA纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的量，杂交分析显示，螺旋化DNA杂交信号强，而未螺旋化DNA信号减弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。但是，Moerkert 等认为未螺旋化DNA不影响进行点杂交分析。

　　3．避免DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切成3～5μm薄片，使每一细胞都被切开。但是，我们认为切片太薄，容易过多地将DNA切断，影响高分子量DNA的获得率。最好是采用15～20μm的厚切片。高浓度蛋白酶K消化2～4天，使能达到细胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并尽可能避免机械性匀浆过程造成的DNA剪切。

　　此外，在NDA释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的DNA剪切。纯化DNA用TE（pH8.0）溶解放4^℃保存即可，若短期不用时应-20℃冻存，但切忌反复冻融，以免DNA降解。

　　四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学

　　由于DNA提取方法的改善和DNA质量的提高，几乎所有基因分析的技术均可用于石蜡包埋组织，但目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、Southern印迹杂交和多聚酶链反应（PCR）。

　　1．点杂交　　鉴于包埋组织DNA有一定程度的降解，因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的方法，特别适用于较大样本的筛选。Dyall – smith等（1988）采用未经抽提的蛋白酶消化产物直接点膜，进行点杂交分析，在3周内对200多病例进行筛选，对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点，再进行原位杂交等方法作进一步证实。

　　2．Southern印迹杂交Southern印迹杂交是经典的基因分析技术，已被广泛地用于基因突变，扩增、重排和丢失等许多方面的研究。石蜡包埋组织的Southern印迹杂交分析有以下几个方面值得注意：