简介
体外监测细胞的增殖对于基础研究和应用研究都极有价值并有潜力应用在临床领域。 3H-thymidine 或 5-bromo-deoxyuridine (BrdU, 胸苷的类似物 ) 掺入法是确定培养细胞的增值率的传统方法，这主要是因为几乎没有更方便的替代方法。因而人们投入了大量的精力来开发一种快速、可重复的用来检测细胞分裂的方法，多数研究最终集中在使用荧光化合物上。然而，现在还没有能够在细胞分裂过程中特异的掺入细胞，并能直接在单细胞水平上检测到的荧光物质。
借助流式细胞仪利用荧光标记的抗 BrdU 的抗体来检测在 DNA 合成过程中掺入的 BrdU 的方法可以间接检测快速增值的细胞。 Hoechst 染料也可被用于检测 BrdU 的掺入，因为 BrdU 掺入的地方其荧光信号被淬灭。这种方法也可被用于细胞增值的研究，特别是细胞循环分析中。然而另一种基于 BrdU 的利用荧光监测细胞增殖的方法是通过光裂解法的链断裂诱导。在这个例子中，新合成的 DNA 中掺入了 BrdU 的细胞在 UV 光裂解诱导 DNA 链断裂后被 Hoechst 33258 染色。用 ChromaTide BODIPY-FL-14-dUTP 作为一种末端脱氧核苷酸转移酶的底物使用一步法可以检测这些断裂。虽然这些方法在检测细胞增殖中相当有用，但他们可能在监测细胞凋亡中更具吸引力。 Molecular Probes Inc. 公司开发了一种用于测量细胞核酸含量的试剂盒 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit ，这种检测方法比以前描述的精确评估体外细胞增殖的方法具有更多的优点。我们开发了在 Genios Plus 利用特别设计的细胞增殖软件采用 CyQUANT Cell Proliferation Assay 检测法的微孔板检测系统。通过这种应用我们希望能够展示这一系统已能够用于贴壁细胞和悬浮细胞的增值测定，特别是同时进行大量样品分析时更具优势。
这种检测方法的特点
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit 试剂盒使这种利用微孔板荧光检测仪的荧光检测法更加方便。这种检测法特别设计用来快速、定量的筛选影响体外不同类型细胞增殖的因子。 R. Haugland 在"荧光探针与研究化合物手册"（ Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals ； edition VI, Molecular Probes, Inc. ）中描述了这种检测方法的细节和优点。然而，当使用 CyQUANT assay 检测法时应该考虑两点。第一，与基于 BrdU 的检测方法不同的是， CyQUANT 检测法并不区分处于增殖期的细胞和处于 S 期的休眠细胞。其次，这种检测方法并不能区分增殖后的细胞群中的健康细胞和受损细胞。这在某些环境下是不方便的。特别是当筛选同时影响细胞凋亡的抑制增殖的因子时。事实上，不能确定并发凋亡的程度可以导致对所测试的因子的抑制效果作过低或过高的估计。很明显后一个问题仅发生在贴壁细胞中，脱离的死细胞会在检测的各步中从板中洗去。此外，在这个例子中，如果 CyQUANT assay 检测法中结合使用合适的荧光素在 Genios Plus 荧光检测仪中 对所检测的活细胞染色可以尽量的避免这一问题。
检测步骤
附件
• CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒（ CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit ， Molecular Probes, Inc.)
• 微孔板荧光检测仪 ( SPECTRAFLUOR Plus , TECAN)
• 细胞生长 / 增值软件
用平滑肌瘤细胞系 MES-SA 和 SKUT-1 作为贴壁细胞模型，用淋巴瘤细胞系 Jurkat 和 Nalm-6 作为悬浮细胞模型。 Molecular Probes, Inc. 简要的给出了实验的方法， MES-SA 和 SKUT-1 细胞在无血清的培养基中过夜培养。然后接种在 96 孔板中（ 5000 个细胞 / 孔）， 96 孔板分别用不同的含有或不含 10% FCS 的细胞外基质 Vitronectin, Fibronectin, 和 I 型、 VI 型胶原蛋白中包埋 9, 27,54 小时。在每个时间间隔轻轻的移去悬浮物，将含有结合细胞的培养板冷冻并保存于 -70°C 等待检测。
检测时，培养板在室温解冻，在避光条件下在每孔中加入 200 m L 的 CYQUANT GR dye/cell lysis buffer, 然后轻轻混合 , 室温孵育 2-5 分钟。在使用装有基于 Excel 的细胞增殖软件的 Genios Plus ( 激发光 485 nm, 发射光 535 nm) 中读板。分别对每一种细胞系使用已知浓度的 CyQUANT 处理的细胞制作标准曲线。为了分析假定的激活因子的细胞表面结合影响下的 Jurkat 和 Nalm-6 细胞的增殖， 细胞相似的首先在无血清的培养基中生长，然后被平分到未包埋的 96 孔板中。加入不同浓度的抗未知的细胞表面抗原的单克隆抗体，按如上所述的在 48 小时和 72 小时监测细胞。在接下来的 CyQUANT assay 检测中的步骤和上面描述的贴壁细胞相同，除了在冷冻之前培养板在 37° C 以 150 x g 离心 5 分钟。实验结果如下图所示：
结果
上两幅图 表明不同细胞外基质对生长在含有或不含胎牛血清的两种平滑肌肉瘤细胞的时间依赖的影响
下两幅图： 表明给定时期内生长在含有或不含血清并含有抗体的培养基中淋巴瘤细胞增殖中单克隆抗体对细胞表面的激活抗原的刺激或抑制作用
结论
这篇应用文章描述了使用荧光微孔板技术监测细胞增殖的应用实例。当前用来评价培养细胞增值率的最可靠、最灵敏的方法是使用 Hoechst, DAPI, Propidium iodide 和类似的染料进行核染色。 Molecular Probes 开发了基于荧光的细胞增殖检测试剂盒（商品名为 CyQUANT ），该试剂盒已被证明在流式细胞检测和微孔板检测中很有用。我们在此表明如果联合使用 Genios Plus 微孔板检测仪和 同时设计的细胞增殖软件，这种检测方法将提供一种高灵敏度的体外检测贴壁细胞和悬浮细胞增值率的方法。这里列出的方法对于大量检测影响这一细胞过程的因素极有价值。
