哈佛尹鹏组开发组织中多蛋白同时成像的新技术

　　为了更好地理解组织和器官是如何发育、功能衰竭以及随着时间的推移而再生的，研究人员想要在三维空间中可视化它们的组成细胞的分子库。"人类生物分子图谱计划"、"人类细胞图谱计划"和几个大脑图谱计划等雄心勃勃的计划正在进行中，这些计划旨在绘制出许多蛋白质(基因表达的产物)在人体器官和组织中单细胞水平上的存在和丰富程度。然而，现有的成像方法在性能、对研究人员的可访问性或两者兼而有之方面通常都受到限制。

　　一项近日发表子啊《Nature Biotechnology》杂志上、由哈佛大学生物工程研究所和哈佛医学院(HMS)一组由Peng Yin博士领导的研究小组完成的最新研究已经填补了这个空白，他们开发了一种新的基于DNA-纳米技术的称为Immuno-SABER（Immunostaining with Signal Amplification By Exchange Reaction的简称）的方法。该方法将常用抗体的蛋白靶向特异性与基于DNA的信号放大策略相结合，使同一样本中的许多蛋白能够在每个目标位点上通过预先可编程和可调的荧光信号进行高度复杂的可视化。该团队已经在广泛的细胞和组织样品中验证了他们的方法。

　　"我们证明了Immuno-SABER提供了独立调节信号强度的能力，可以使单个蛋白质目标的信号强度增加5至180倍，而且允许同时检测许多蛋白质。该技术具有速度快、相对容易使用和成本低的优点，有潜力在许多组织和疾病中快速推进正在进行的大规模蛋白质图谱研究和生物标志物发现的工作。"

图片来源；Nature Biotechnology

　　基于他的团队在利用DNA纳米技术驱动的条形码和信号放大技术方面的进展，Yin最近还被选为人类生物分子图谱项目(Human BioMolecular Atlas Program，HuBMAP)和人类细胞图谱项目（Human Cell Atlas Project）的获奖者。他也是威斯研究所(Wyss Institute)分子机器人计划(Molecular Robotics Initiative)的联合负责人，也是HMS的系统生物学教授。

　　抗体是研究和临床环境中最常见的蛋白质检测试剂。它们通常带有荧光标记，以便用显微镜检测。然而，传统的抗体染色方法通常最多只能同时使用五种不同的染色剂，靶蛋白的丰度差异很大，很难从许多组织显示的背景荧光中分辨出敏感性高的罕见蛋白靶。

　　Immuno-SABER利用Yin课题组先前报道的"引物交换反应"(Primer Exchange Reaction，PER)方法，在DNA发夹结构的催化作用下合成短DNA引物序列的长串联体。每个生成的串联体通过短处理序列连接到抗体上的DNA条形码上，这些抗体与固定细胞和组织样本中的目标蛋白结合，具有很高的特异性。在靶区，SABER串联体为互补荧光寡核苷酸("imagers")提供了一个具有多个结合位点的支架，从而可以放大从每个蛋白靶发出的信号。

　　"通过对具有独特短DNA序列的抗体进行条形码编码，并应用Immuno-SABER，我们可以同时在同一样本上看到多个蛋白靶点，具有很高的特异性。这本质上开辟了一种以强有力的、多途径的方式方法来分析组织中存在的蛋白质多样性的方法。"该研究共同第一作者和共同通讯作者、Yin课题组之前的博士后研究员Sinem Saka说道。

　　该团队通过将其与之前开发的"DNA交换"技术相结合，显着提高了Immuno-SABER方法在多方面应用的潜力。在DNA交换过程中，标记一组目标蛋白的成像剂被清洗掉，取而代之的是另一组标记另一组目标蛋白的成像剂，这一过程可以重复多次。

　　以前开发的用于高复用蛋白检测的方法，通过在不同的蛋白目标上重复它们的一些关键步骤来实现目的，这往往会受到次优敏感性的影响，或者需要相当长的时间(低吞吐量)和高超的技巧来实现。Yin研究小组的研究生、第一作者之一Yu Wang说，"交换-SABER"通过一个染色和放大步骤提供了高灵敏度，通过多个快速图像交换步骤提供了高复用和高通量。"作为概念验证，我们在小鼠视网膜的冷冻过程中观察到了10种不同的蛋白质。"

　　Wang的共同指导教授是合着者George Church博士，他是威斯研究所的核心成员，同时也是哈佛大学和麻省理工学院的遗传学教授和健康科学与技术教授。

　　Immuno-SABER促进同时检测许多蛋白质的另一个关键方面是它调节信号强度的能力。该团队通过从每生成一个包含更多荧光成象结合位点的串联体中组装更复杂的支链结构来实现这一目标。"通过对基于PER的串联体结构的复杂性进行编程，我们可以根据特定蛋白质的丰富程度调整信号强度。我们可以同时看到带有分支的SABER产物的稀有蛋白质，能够实现更高的信号放大，以及带有线性SABER产物的丰富蛋白质。"在他们的研究中，研究小组结合了线性和分支的SABER串联体，例如，在人类扁桃体样本中同时显示了6个不同丰度和细胞位置的蛋白质目标。

　　Yin的团队现有的一系列DNA纳米技术成像技术，包括DNA涂料和离散分子成像技术，已经推动了超分辨率显微镜的研究领域的进展，使研究人员能够在正常位置研究单个分子。为了在更复杂的组织环境中获得同样高的蛋白质分辨率，研究小组将免疫SABER和一种被称为"膨胀显微镜"的方法结合起来，这种方法以前是由麻省理工学院神经技术Y. Eva Tan教授Edward Boyden博士开发的。膨胀法将固定的组织人工膨胀到更大的体积，增加了单个分子之间的分离距离，从而提高了它们的有效分辨率，而不需要专门的仪器。Wang说："将膨胀显微镜和交换-SABER结合起来，我们就能同时实现高复用、高通量和高分辨率的功能，从而更有效地推进构建人体分子图谱等工作。"

　　"Peng Yin的团队再次展示了他们如何程序设计DNA分子执行特定的任务，比如分子机器人，在这种情况下让我们同时看到众多的位置与高分辨率的人类细胞和组织内的蛋白质，这将大大加快发现生物控制的分子机制以及新的疾病生物标志物，"Wyss学院创始董事、哈佛大学工程与应用科学学院(SEAS)生物工程教授、医学博士Donald Ingber说道。