不同的细菌具有各自的独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。生理生化特性的测定主要根据Shirling & Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。
（一）碳水化合物代谢实验
糖（醇、苷）类发酵实验
（1）原理：
细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物
（2）基本培养基：
在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
（3）实验方法：
取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。
（4）结果判定：
如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。如，发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。
（5）应用：
是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
氧化型与发酵型(O/F)的测定
（1）原理：
细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加的，称为氧化型，细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。
（2）培养基：
培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解；分装试管，3～4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出后冷却成琼脂柱。
（3）实验方法：
挑取18～24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中1管覆盖1mL灭菌的液体石蜡，37℃培养24小时或更长时间。
（4）结果判定。
Β-半乳糖苷(ONPG)实验
（1）原理：
有的细菌可以产生β一半乳糖苷酶，能分解邻－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黄色的邻－硝基酚，在很低浓度下也可以检测出。
（2）培养基：
邻硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01mol／L pH7.5磷酸缓冲液1000mL，pH7.5的灭菌1%蛋白胨水300mL。先将前两种成分混合溶解，过滤除菌，在无菌条件下与1％蛋白胨水混合，分装试管，每管2～3mL，无菌检验后备用。
（3）实验方法：
取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。
七叶苷水解实验
（1）原理：
有的细菌可以将七叶苷分解为七叶素和葡萄糖，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。
（2）应用：
主要用于肠球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性，也可用于革兰氏阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。
甲基红实验
（1）原理：
细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4.5以下时，加入甲基红指示剂而变红，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如，醇、酮、醛、气体和水等）则培养基的pH值仍在pH6.2以上，故加入甲基红试剂呈黄色，为阴性。
（2）实验方法：
一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72h，取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，橙色者为可疑，黄色者为阴性。
（3）应用：
主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性后者为阴性。
V-P实验
（1）原理：
有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸, 丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰,二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基发生反应生成红色的化合物。若培养基中的胍基含量过少，则可加入少量含胍基的化合物等。
（2）V-P试剂：
肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。
（3）实验方法：
接种实验菌于葡萄糖蛋白胨水培养基(与甲基红实验相同)中，每次两个重复，置适温培养2-6d，取培养液和40%NaOH等量相混，加入少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为实验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。
（4）应用：
本实验常与甲基红实验一起用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。