色谱质谱联用技术

　　色谱质谱联用技术

　　一、联用技术的必要性

　　每种分析方法都有其特长和局限性。在线联用不仅能取长补短，而且还具有协同作用，获得两种技术单独使用时所不具备的某些功能。

　　色谱用于分离，而光谱用于结构鉴定，两者联用，不仅可以对混合物中的各未知组分进行定性，也可用于定量分析。

　　二、气相色谱－质谱联用(GC-MS)

　　1、GC-MS-Computer的工作过程：

　　GC：各组分被色谱柱分离，随时间变化依次从柱子流出，通过接口进入MS

　　MS：连续扫描MS图，每扫描一张MS图需花费约零点几到几秒钟。总扫描时间＝(扫一张图谱的时间)×扫描次数

　　计算机：将得到的所有MS数据存储起来，供下一步的处理和输出。

　　2、气质联用系统提供的信息

　　（1）总离子流图（TIC）：

　　质谱仪检测到的所有离子信号（不分其质荷比）的总和对时间t作图；

　　相当于气相色谱图。没有组分通过时为基线；当组分流出时，即出现峰。

　　注：TIC图中的每一个峰代表一个组分；峰的位置就是该组分的色谱保留时间；峰面积与组分的相对含量有关。

　　（2）每个组分的质谱图：

　　可从质谱图获得组分的分子量和分子结构信息。

　　谱库检索：根据NIST，INCOS，PBM三种算法，将未知物图谱与谱库中的标准图谱比较，匹配度越高，可信度越高

　　（3）质量色谱图（提取离子流图）

　　以指定质荷比的离子强度（而不是总的离子流强度）对时间t（或扫描号）作图。

　　是计算机进行数据处理得到的图。

　　优点：可在复杂混合物的TIC图中,迅速找到所需检测的化合物或同系物。

　　3、GC-MS的应用

　　A环境污染物的分析

　　B香精、香料的成分分析和质量评价

　　C中草药的挥发性成分鉴定

　　D药物及其他化工产品的分析

　　E毒物、毒品及违禁药物的鉴定和检测等等

　　三、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)

　　1、液质联用与气质联用区别

　　气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。

　　液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

　　2、常见术语

　　质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/z.

　　峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.

　　离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度.

　　基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.

　　总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子

　　3. 如何看质谱图：

　　(1)确定分子离子,即确定分子量

　　氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。

　　(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式

　　高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式

　　低分辨质谱利用元素的同位素丰度，

　　(3)峰强度与结构的关系

　　丰度大反映离子结构稳定

　　在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。

　　(4)质谱解析的一般步骤

　　适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好

　　(a)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当

　　(b)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等.

　　(c) 尽可能判断出分子离子。

　　(d) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......

　　(e)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。

　　4. 离子源

　　EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。

　　CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。

　　FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。

　　FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。

　　ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离—属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)

　　APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离—同上，更适宜做弱极性小分子。

　　APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离—同上，更适宜做非极性分子。

　　MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子．

　　5定性分析流程

　　在考虑使用质谱仪（MS）之前，应当考虑分析工作的类型、预期获得的结果等：

　　定性分析准备工作

　　了解样品其他知识，如熔点，沸点，溶解性等理化性质，合成路线，光谱，波谱数据等；可能含有的杂质，样品大致含量等；进行LC-MS分析前最好确定LC条件，能够基本分离，流动相缓冲体系符合MS要求；色谱柱和管路的清洗：某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，尤其是采用针泵进样时，应先用空白溶剂充分清洗管路。

　　如原来溶解样品的溶剂,若不合适LC-MS,N2吹干,再用流动相定量溶解。溶解样品的溶剂和流动相不一致，得到的谱图不纯，峰形不好，变宽，出怪峰；

　　某些固体直接用流动相不溶，可以先加一滴DMSO，再加甲醇或乙腈等稀释；

　　进样顺序要先稀后浓，定量溶解，浓度控制在几个ppm级，不然易污染系统，造成本底太高影响分析结果。

　　色谱柱选择

　　选择原则:定性可长些,能够基线分离最好，若做不到，可以通过提取离子EIC来得到较好的色谱图。内径无要求，粗细均可；

　　一些特殊的化合物必需使用特殊的色谱柱进行分离，相关的知识可以向色谱柱供应商索取。

　　大多数著名的色谱柱厂商都有自己的色谱柱分析数据库，里面可能会有想要的信息。

　　正、负离子模式的选择

　　正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式；负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。

　　流动相的选择

　　常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。

　　LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmoL/L。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5 mmol/l。

　　送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。

　　6影响分子量测定的因素

　　1）pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形。

　　2）气流和温度：当水含量高及流量大时要相应增加。

　　3）溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。

　　4）溶剂和缓冲液的类型：通常正离子用甲醇好，负离子乙腈好些

　　5）选择合适的液相色谱类型：正相、反相、选择合适的色谱柱

　　6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时回使多电荷离子比例低，多聚体也减少

　　7）样品结构和性质

　　8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好

　　9）样品浓度不够，有时需要浓缩

　　7 应用领域

　　医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析

　　生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖

　　环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析

　　临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸

　　食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物

　　法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测

　　兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体

　　合成化学：有机金属化合物、有机合成物

　　有机化学：表面活性剂、染料