质谱流式和光谱流式的原理和优缺点介绍

　　流式细胞仪仍然是无与伦比的单细胞分析技术，分析数百万甚至更多细胞上的多个荧光参数的能力，使得流式能够帮助人类深入理解复杂的生物过程。然而，常规流式在发展过程中，渐渐表现出一些缺陷，主要表现为荧光染料的限制，即使方案经过精心设计，也无法避免光谱渗漏、自发荧光等问题，使用的荧光染料的数量越多，这些问题就越大。

　　质谱流式

　　为了克服这个问题，先是出现了质谱流式。质谱流式的基础原理是飞行时间质谱（TOF-MS），TOF-MS是一种非常精确和稳健的方法，用于测量离子的质荷比。在TOF分析中，所有离子通过已知强度的电场加速，并且测量这些离子在已知距离上到达检测器所花费的时间。离子越重，到达探测器所需的时间越长。

　　在质谱流式中，选择的标记是高度纯化的稳定同位素。

　　为了进行质谱流式检测，需要将同位素引入TOF并且避免细胞污染仪器，这就需要将细胞气化，仅留下同位素，为此，在进行TOF之前，需先将引入电感耦合等离子体（ICP）使细胞气化，将剩余的金属离子引入TOF检测。

　　所以，通过稳定同位素抗体的标记，经过ICP的细胞气化，最后通过TOF-MS检测离子，三者合一，就是质谱流式。原理绘制成一张图就是下面这样： [null]

　　质谱流式的优点：

　　 可以使用传统的标记技术，在方法学上改变很小

　　 在质谱细胞计数中没有“自发荧光”，因为细胞内部不含镧系元素离子

　　 无“补偿” 或补偿非常微小

　　 方案设计更容易

　　但任何事物都有局限性，质谱流式的缺点：

　　 与传统的流式细胞仪相比，采集速度更慢，每秒一般最多约1000个事件

　　 样品制备必须比传统流式更干净，因此在获取时所有生物材料都会气化，如果不干净可能导致碳积聚并降低灵敏度

　　 商业标记抗体数量有限（不过目前越来越多厂家加入，使得这些目录逐渐在完善）

　　 复杂的数据结构，需要新的数据分析工具和方法

　　 由于细胞被气化，所以没法进行FSC和SSC测量

　　光谱流式

　　光谱流式是从另一条路解决荧光补偿问题，就是光谱解析，解析原理见下图，需要事先学习荧光素的光谱特征，不同荧光素都有其独特的光谱特征，有点像人脸识别似的，只不过比人脸识别简单多了。通过这种解析，就智能得消除了常规流式累死人的荧光渗漏影响： [null]

　　但实际上在硬件上，光谱流式同时还大大降低了光路的复杂程度，使得仪器成本能够大大降低。常规流式要做到12色，可能需要12～14个独立检测器和40多个滤光片，而光谱流式，不仅避免了这种复杂架构，而且实现同等参数检测的仪器成本只有常规流式的五分之一。 [null]

　　光谱流式最开始是Purdue大学2004年ISAC会议上提出的，2007年10月9日获得ZLUS7280204（http://www.cyto.purdue.edu/sites/default/files/manuscripts/US7280204-issued-patent.pdf），ZL后来授权给了索尼，Purdue大学该页面（http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry）还有几个蛮有意思的声明，在此不方便直接翻译，不知道是否有知情人能解答一下？

　　对于光谱流式，同样也有优点和缺点。优点是：

　　 与常规流式在方法学一致，可直接拿来就用，过渡性好

　　 能通过特异性光谱特征，方便地去除“自发荧光”信号

　　 即使以前发射波长相近的荧光素，例如GFP和FITC，由于波形不一样，在光谱流式上也能解析开

　　 方案设计更容易

　　缺点：目前在公开资料中未找到对光谱流式的缺点介绍，但事物都有两面性，我个人虽然未用过光谱流式，但从光谱流式公司公开资料上的光谱流式与常规流式数据对比上看，可以看出在信号强度上，部分荧光素的强度整体是要弱于常规流式的，这可能对于某些微弱信号会有点麻烦，当然，这纯属个人猜测，请用过光谱流式的FLOWER能够出来确认一下。