亚硫酸氢盐修饰后测序法检测甲基化

重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用PCR扩增（引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点的甲基化状态。

DNA

NaOH 苯二酚（氢醌） 亚硫酸氢钠 石蜡油

离心管 恒温水浴锅 铝箔纸

1.将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2.加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 

3. 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

4.10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5. 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6.EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 

7.加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8.50℃避光水浴16h。

避免化学品或外源DNA的污染。

甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。

第一部分 基因组DNA的提取。

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1：紫外分光光度计计算OD比值；

2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3： 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。

这一步细节：

1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。