Southern印迹实验

DNA

HCl NaCl Tris NaOH SSC 溴化乙锭

电泳仪 紫外透射仪

一、向上毛细管转移法的转移叠层系统：

图一、向上毛细管转移法的转移叠层系统，A表示海绵法，B表示滤纸桥法
 

二、实验步骤

1.  用适当的限制性内切酶消化DNA，与合适的DNA分子量标准一起进行琼脂糖凝胶电泳。

2.  用溴化乙锭染色，在凝胶的侧沿放一把直尺进行照相，便于以后识别电泳带在膜上的位置。

3.  按如下方法处理凝胶，室温下轻轻摇动，要确保凝胶被完全覆盖。

（1）蒸馏水：约10倍于凝胶体积的0.25 mol/l HCl，30 min。

（2）蒸馏水：约10倍体积的变性液，20 min，2次。

（3）蒸馏水：约10倍体积的中和液，20 min，2次。

4.  如图一所示安装转移叠层系统，其各层组成依次为

（1）海绵或固体支持物，置于一个盛有足以浸没海绵一半高度的20XSSC的平皿中。

（2）1张Whatman 3 MM 滤纸桥，3张Whatman 3 MM 滤纸，凝胶，包裹于凝胶边缘的塑料薄膜。

（3）1张在蒸馏水中平衡过的尼龙膜（或用蒸馏水浸湿，然后在20XSSC中平衡10 min 的硝酸纤维素膜），5张 Whatman滤纸及一叠4 cm 纸巾塔。

（4）每加一层均将其用20XSSC浸湿，并用一根10 ml 玻璃吸管在其表面小心地滚动以除去所有气泡。

5.  将一块玻璃平板放于叠层上面，其上加一重0.2~0.4 kg 的重物以使各层固定，放置过夜。

6.  取出杂交膜，用铅笔在膜上标记样品孔的位置，井切去一角以标示方向。

7.  用2×SSC漂洗杂交膜，然后将其放在一张Whatman 3 MM 滤纸上，使其完全干燥。

8.  将尼龙膜置于可透过紫外线的塑料夹层中，带有DNA的一面朝下，置于紫外透射仪（波长254 nm）上进行照射。

9.  膜干燥后可夹在2张Whatman 3 MM 滤纸之间，室温下放置数月。