批量层析方法筛选poly(A)+RNA

总 RNA

吸附 洗涤缓冲液 醋酸铵 乙醇 冰预冷的水 NaCl TES

比色杯 微量离心机 Oligo (dT)18-30—纤维素 旋转轮 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

吸附/洗涤缓冲液（含 0.5 mol/L NaCl 的 TES 缓冲液）

醋酸铵（10 mol/L）

乙醇

冰预冷的水

NaCl（5 mol/L）

TES

2. 核酸和寡核苷酸

总 RNA

3. 专用设备

用于测量 260 nm 吸光值的比色杯

有速度控制的微量离心机

Oligo (dT)_18-30—纤维素

旋转轮

55℃ 和 65℃ 的水浴

二、方法

1. 在一系列灭菌微量离心管中，将每份总 RNA ( 上限为 1 mg ) 样品的体积用 TES 调整到 600 μl。封好管口，在 65℃ 加热 10 min，然后迅速在冰上冷却到 0℃ 。每份样品加 75 μl ( 0.1 倍体积）5 mol/L NaCl。

2. 在每管中加 50 mg ( 500 μl) 平衡的 oligo (dT)—纤维素，盖好管盖，室温下在旋转轮上温育 15 min。

3. 用微量离心机在室温下离心，600~800 g ( 约 1500~2500 r/min)，2 min。

4. 将上清移到一系列干净的离心管中，置冰上存放。

5. 在含 oligo (dT) 的沉淀中加 1 ml 冰预冷的吸附/洗涤缓冲液。温和旋涡震荡分散沉淀。将盖好盖子的离心管置于旋转轮上，室温下温育 2 min。

6. 室温下，用微量离心机离心，600~800 g ( 约 1500~2500 r/min), 2 min。弃上清。 重复步骤 5 和 6 两次。

7. 在含 oligo(dT) 的沉淀中加 0.4 ml 冰预冷的双蒸灭菌水，温和旋涡震荡以重悬沉淀。立即在微离心机上离心，4℃，2 min。

8. 小心吸去上清。

9. 回收结合的 poly(A)⁺ RNA：用 400 μl 双蒸灭菌水重悬沉淀，在 55℃ 温育 5 min，然后 4℃ 离心 2 min。

10. 将上清移至一系列干净的离心管中，重复步骤 9 两次，合并所有上清。

11. 在上清中加 0.2 倍体积的 10 mol/L 醋酸铵和 2.5 倍体积的乙醇，在 -20℃ 存放 30 min。

12. 回收沉淀的 poly (A)⁺ RNA： 4℃ 离心，最大速度，15 min。小心弃上清，用 70% 乙醇洗沉淀，短暂离心，吸去上清，将管盖打开，倒置数分钟，使大部分残留的乙醇挥发。

13. 用小体积灭菌的 DEPC 处理的水溶解 RNA。

14. 估计 RNA 浓度。

15. 保存样品。