离体神经突触的代谢性标记实验

固定剂 温育液 氯霉素 放射自显影乳剂 显影剂 SDS样本缓冲液

一、放射自显影

神经元在条件培养基中培养 2d，如第十章所述。

1.用一个锋利的微电极从胞体分离神经突起，并用牵引电极将胞体移出培养皿 (见第十章)。

2.在培养液中加入终浓度 0.lmmol/L 氯霉素，阻断线粒体蛋白的合成。

3.小心移去培养液并用温育液洗涤 6 次，每次 Imin。保证轴突始终被一小部分液体覆盖；一旦干了，轴突便会崩解。

4.在含 0.5mCi/ml 反式-³⁵S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的温育液内标记 30 min。

5.用含 lmol/L 未标记半胱氨酸和蛋氨酸以及 0.1_d/L 氯霉素的温育培养液洗漆 6 次，每次 40 min。

6.用 1% 的多聚甲醒和 1% 的乙酸固定 2 h。

7.用一系列浓度递增乙醇脱水。

8.于空气中干燥。

9.浸入放射自显影乳剂。

10.曝光 2~7 山具体时间根据 35S 标记掺入蛋白的速度而定。

11.D19 中显影。

12.水中短暂漂洗。

13.20%Na₂S₂O₃(硫代硫酸钠）水溶液固定。

14.水洗漆 20 min。

15.封片液或甘油封片。

二、聚丙烯酰胺凝肢电泳

1.从胞体分离神经突起并去胞体。

2.0.1 mmol/L 氣霉素预温育分离的神经突起 30 min。

3.用温育液洗漆 6 次，每次 Imin。

4.在含 0.5mCi/ml 反式-³⁵S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的温育液内标记 2.5 h。

5.温液洗涤 6 次，每次 30 min。

6.20ul SDS 样本缓冲液收集神经突起，并转移入微量离心管。

7.煮沸 5 min。

8.样本于 12OOOr/min, 离心 2 min。

9.取上清液加样到 8% SDS-PAGE 进行电泳。

10.50% 甲醇和 10% 乙酸固定凝胶 30 min。

11.用扩增仪处理凝胶 20 min。

12.千燥凝胶。

13.在 X 射线胶片（KodakBiomaxMS) 上曝光 1~3 周。

14.显影胶片

三、结果

为了解神经突起内蛋白的合成部位以及这些部位合成蛋白的异质性，我们应用反式-³⁵St 示记技术通过 ³⁵S 标记的半胱氨酸和蛋氨酸标记了离体神经突起。如果离体轴突确实存在蛋白合成，那么这些放射标记的氨基酸将能够掺入蛋白，并被放射自显影方法检测到。结果证明神经突起能够合成各种各样的蛋白，而且这个过程主要发生在曲张体和生长锥（图 3-6)。