彗星实验在环境毒理学中的应用实验

一、材料

1.溶液

1.2 玻璃器具和实验器材

（1） 移液器。

（2） 吸 头（10、 20、 100、 200、 1000 uL)。

（3）刻 度 烧 瓶（100 m L 、 500m L 和 I L )。

（4）量筒（100 m L 、 500 m L 和 1L )。

（5）烧杯（250 m L 、 500 m L 和 1L )。

（6）培 养 皿（120 m m 直径）。

（7）洗 瓶（用于超纯水）。

（8） 冰盒。

（9）冻 存 管（1.0 m L )

（10）Eppendorf 管（0 •5 m L 、 I.5 m L )。

（11）带旋盖的离心管（50 m L )。

（12）塑料/玻 璃 盘（如吸头容器的盖子或底盘)。

（13）显微镜用载玻片。

（14）显微镜用盖玻片。

1.3 仪器

（1）p H 计。

（2） 分析天平。

（3） 磁力搅拌器和搅拌棒。

（4）电源，以提供低电压和高电流（如 300 V ， 2000 m A )。

（5）水平电泳仪。

（6）慑子。

（7） 剪子。

（8）Gelbond 胶（琼脂糖凝胶支持介质）（Mandel cat. no. 53740 G B 1638)。

（9）L a b T e k I[小 室（NalgeNunccat. no. 154461-B )。

（10）加热器或者水浴锅。

（11）有彗星图像分析软件的计算机（Kinetic Komet 5. 5 或其他）。

（12）带有40倍油镜的突光显微镜（Zeiss AxioPlan U 或其他）和合适的激发/发射

滤 光 片（如 S Y B R Gold: 激发光300n m ，发射光495/537 n m ，染核酸）

二、 方法

1. 校准

彗星实验的校准可通过评判经电离辐射（X 射 线 或 γ 射线）或 化 学 处 理（过氧化氢、环磷酰胺或M M S ) 后引起的细胞D N A 损伤得以进行（见注释7) (I, 4, 5)。做一条剂量效应曲线以判断此项技术的敏感性（图 2)。每次使用新物种和不同细胞系都需进行校准。有些实验室通过同时进行阳性对照（如放射或化学处理）来确保每次彗星实验的一致性

2. 细胞活性

凋亡或坏死的细胞并不表现出典型的彗星图像。相反，它们的头部很小或根本没有而彗尾则大且弥散（图 3 ) 这些细胞常被称作泪滴状细胞、鬼影细胞或刺猬细胞（1，4)。这类细胞能通过细胞毒物和（或）非遗传毒物诱导产生，应该在分析时被排除。细胞暴露于遗传毒物也会出现这种类型的图像，此时则应纳人数据分析。因此，需要对细胞悬液进行细胞毒性的同期测定以确定细胞严重受损的原因以及这些细胞是否应被归人数据分析。
细胞活性的检测首选以下两种方法之一。第一种是用双重染色活性实验（6)。在这个实验中，将等体积的细胞悬液和E B /突光素二乙酸酯工作液（见 2 . 1 中 7 ) 混 合 ，然后滴在血细胞计数板的两边（10 fxL)。不论死细胞还是活细胞都将同时通过荧光显微镜计数 。有代谢能力的细胞（活细胞）通过细胞酯酶将荧光素二乙酸酯转化成代谢焚光素
从而显现绿色荧光；而 没有代谢能力的细胞（死细胞）因为细胞膜通透性改变， D N A被溴化乙锭染色从而显现红色。另一种方法是用台盼蓝排除实验法。在这个实验中，将等体积的细胞悬液和台盼蓝溶液相混合，分别滴在血细胞计数板的两边（I O m L ) , 通过普通显微镜在一定时间内计数死细胞及活细胞（通 常 在 2〜5m i n 内）。着色的细胞没有
活性 ，而无色透明的细胞则为活细胞 。 一 般 而 言 ，样 本 中 阴性对照中活细胞比例在7 0 % 〜7 5 % 以下的不应进行后续分析。

3. 种属差异

前提是活细胞的情况下彗星实验能在几乎所有有核细胞中进行。但在某些种属的细胞（如鸟类）中，全血不适于彗星实验，因为超 过 8 0 % 的 细 胞 表 现 为 「鬼影细胞」或「刺猬细胞」，有可能是由于降解和有核成熟红细胞中功能惰性的 D N A /R N A 。此种情况下 ，白细胞需从有核红细胞中分离才能进行彗星实验。两栖类的全血细胞则无此现象。

4. 评判损伤的标准

为了量化D N A 损伤，胶 染 色（如 E B 、 S Y B R Gold、 S Y B R G r e e n ) 后在荧光显微镜下观察 D N A 的迁移，通 过 合 适 的 软 件 包 如 K o m e t 5. 5 (Kinetic Imaging, Nottingh a m , U K ), C o m e t Assay F (Perceptive Instruments， Suffolk, U K ) 给彗星打分。受损细胞会呈现出类似星空中彗星的图像，有一条含 D N A 的长尾巴从受损细胞的核中央迁移出去。损伤程度主要运用到三个重要值：彗尾 长 度 、尾 矩（彗尾长度与彗尾中D N A 的百分比乘积）或 Oliv e 尾 距（彗尾重心到彗星头部中心位置的距离乘以D N A 在彗尾中的百分含量）以及尾部D N A 的 百 分 比 含 量（7, 8)。由于不同的图像分析软件用不同的方法计算这些指标，因而哪个指标最有效目前尚未定论。
当暴露于低剂量的遗传毒性物质时，尾长会随之迅速增加，但是在较高浓度时，尾长的变化会到达一个平台（9)。然而在彗尾区域D N A 的含量能够随着毒物剂量的增加而持续增加，理论上从〇〜100% (7)。所 以 ，随着剂量的增加，彗尾密度持续增加而不 是 尾 长 增 加（图 2)。由于尾矩是基于长度计算的，因此有人认为彗尾密度或者彗尾D N A 百分含量应作为最好的衡量遗传毒性的标准。

5. 冻存样本

当 彗 星 实 验 不 能 在 样 本 收 集 后 立 即 进 行 ，样 本 可 以 在 液 氮 中 冻 存 直 至 合 适 的 时 间 ，前 提 是 它 们 放 置 在 合 适 的 细 胞 冻 存 液 中（11-13)。我 们 发 现 对 于 血 液 样 本 ，无 钙 镁 PBS加 上 10% DMSO或者无 钙 镁 PB S加 上 1 0 % DMSO和 20 m m o l Z L EDTA ( 1 2 ) 可以作为 合 适 的 细 胞 冻 存 液 。样 本 需 要 在 室 温 下 水 浴 解 冻 ，并 且 立 即 进 行 后 续 实 验 。但 是 由 解冻样本所进行的彗星实验得来的数据不能直接与非解冻样本所得的数据进行比较，因为解冻过程会提高D N A 迁移的背景值。因此，对照试验也应当控制在相同条件下（冷

冻）。

6. Gelbond胶碱性彗星实验

7. 其他与环境毒理学相关的彗星实验技术

三种由普通的碱性彗星实验改良而来的方法也可作为研究环境毒理学和基因组学的有力工具。首 先，彗星实验可与荧光原位杂交技术（F IS H )结合以确定D N A 断裂发生在基因的哪个区域（14, 15)。 第二种方法，彗星-DNA弥散实验，通过在彗星实验中不经电泳而用乙醇沉淀D N A , 来区分细胞死亡的类型[如凋亡（细胞程序性死亡)]和 坏 死（在损伤或疾病中死亡的细胞）（16)。此外，也可通过在中性缓冲液而非碱性缓冲液中进行彗星实验来检测DNA双 连 断 裂（5, 17)。这项技术也能评价生殖细胞中的D NA 损伤，这种损伤通常有高水平的碱性不稳定位点（5, 18, 19)(见注释6)。

栖类全血细胞需染色约30 min