用有机溶剂抽提法从DNA中除去溴化乙锭实验

DNA 样品

乙醇 水饱和的异戊醇或 n-丁醇 酚 TE

透析管和夹 离心机和转头

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇，水饱和的异戊醇或 n-丁醇（从离心制备的 DNA 中去除溴化乙锭要上述两种有机溶剂之一。），酚，酚：氯仿（1:1, V/V)，TE ( pH 8.0)。

2. 核酸和寡核苷酸

通过 CsCl 梯度离心纯化的 DNA 样品

3. 离心机和转头

带有 HL-4 的转头和 50 ml 离心管的 Sorvall RT-6000 离心机（或与其相当的设备）

Sorvall SS-34 转头（或与其相当的转头）

4. 专用设备

透析管和夹或用于旋转透析的微量浓缩器（Amicon) 。

二、方法

1. 提取 DNA 溶液、去除溴化乙锭

(1) 将 DNA 溶液加到玻璃管或塑料管中，加入等体积的水饱和的 n-丁醇或异戊醇，盖紧管盖。

(2) 振荡混合有机相和水相。

(3) 在室温下离心该混合物 3 min，450 g ( 用 HL-4 转头和 50 ml 的离心管在 Sorvall RT-6000 离心机上为 1500 r/min ) 或放置于室温直到有机相和水相分离。

(4) 用巴斯德吸管将上层有机相（呈漂亮的深粉红色）转移至适当的废物容器中。

(5) 重复抽提（按第 1~4步）4~6 次直到水相和有机相均不见粉红色。

2. 从 DNA 溶液中去除 CsCI

(1) 用乙醇沉淀法（按第 7~12步）从 DNA 溶液中去除 CsCl，或用微量浓缩器（Ami-con ) 进行旋转透析或用 2L TE ( pH 8.0 ) 过夜透析 16 h ( 不断换缓冲液 )。如果是用后两种方法之一，则可直接进行步骤 8。

(2) 欲从 CsCl-DNA 溶液中沉淀 DNA，则加入 3 倍于 CsCI 溶液体积的水，充分混匀。

附加的该步处理使 CsCl 得到稀释并防止其被乙酵沉淀。

(3) 向 DNA 溶液中加入 8 倍体积的乙醇（在第 2 步用水稀释前的 CsCl-DNA 溶液的体积为 1 体积）并充分混合，于 4℃ 存放至少15 min。

若让沉淀反应于 4℃ 过夜，则能得到较高的 DNA 回收率。

重要：若 DNA 的乙醇溶液存贮于 -20℃，则 CsCl 会沉淀。

(4) 在 4℃ 下用 20000 g 离心（Sorvall SS-34 转头 13000 r/min）15 min 收集 DNA 沉淀。

(5) 将上清液移注到洁净的离心管中，并加入等体积的乙醇溶液。于 4℃ 放置此混合物至少 15 min，然后于 20000 g 离心 15 min ( Sorvall SS-34转头 )，收集 DNA 沉淀。

(6) 用 70% 的乙醇洗涤上述两次所得的 DNA 沉淀，然后尽可能去除所加的 70% 的乙醇，并让残留液体于室温下挥发。

(7) 用 2 ml H₂O 或 TE ( pH 8.0 ) 溶解 DNA 沉淀。

若用于 DNA 测序，DNA 应溶于 H₂O 中；若 DNA 需长期保存，TE ( pH 8.0 ) 是更好的选择。

(8) 若此重溶后的 DNA 从其颜色或当在紫外线照射时发出的荧光判断还明显含有溴化乙锭，则再次用酚或酚：氯仿抽提一次，然后再用乙醇沉淀 DNA。

(9) 测定 DNA 终溶液的 OD₂₆₀ 值，计算 DNA 的浓度。分装成小份贮存于 -20℃。