基于PCR的DNA文库筛选实验方法

PCR 混合物 PCR 引物寡核苷酸 杂交寡核苷酸 PCR 正对照 PCR 主要混合物 蒸馏水

琼脂糖凝胶电泳设备

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

蒸馏水

2. 酶和酶缓冲液

PCR 混合物（可以放在一起冰冻），对于 lml 反应，包括：200nmol 的各种 dNTP;1XVent 溶液或等价物；2.5umol 的 MgCl₂；2nmol 的各引物

PCR 主要混合物（每个反应必须新鲜配置）：lulVent DNA 聚合酶或等价物；99ul 上述 PCR 混合物

3. 核酸和寡核苷酸

2 个 PCR 引物寡核苷酸

1 个杂交寡核苷酸

PCR 正对照：10ng 全基因组 DNA 或能产生阳性 PCR 信号的起始文库组分（见第 5 步）

4. 培养基

LB，1L 水中加入：10 g 蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 gNaCl, 用 NaOH 调节 pH 至 7.5SM,1L 水中加入：5.8 gNaCl、2 gMgS0₄、50 ml1mol/LTris-HCl(pH7.5)、5 ml2% 的明胶。

含10mmol/LMgSO₄ 的 LB

5. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳设备，包括溴化乙锭

6. 其他

96 孔板（CorningCostar)

聚酯封口膜（NalgeNuncInternational)

噬菌斑杂交所需材料

7. 载体和细菌菌株

用噬菌体载体构建的 DNA 库

用于扩增文库的细菌菌株

二、方法

在筛选 DNA 文库之前，需要测定几个参数来建立有效的实验条件。这些参数如下。

1.PCR 条件。用筛库的引物改变退火温度和循环次数，以得到最大量的特异产物。模板的来源可以是将要筛选的文库（10⁶ 个噬菌体顆粒）或者是 1ng 的全基因组 DNA。在PCR 过程中，噬菌体 DNA 释放作为模板。因此，在反应之前不需要提纯噬菌体 DNA。可以使用的典型引物应该产生 0.1~1.0kb 的产物（16~24 个核苷酸长度，50%G+C 含量）。如果需要（比如，当用与不同外显子配对、横跨一个大的内含子的引物时），目的序列可能比1kb 长，但产物的量可能会减少。

2. 确定文库中基因的丰度。用上面所建立的 PCR 条件，通过改变加入噬菌体的数目定量文库。能产生 PCR 产物的噬菌体的最小数目就是实验确定的该基因在文库中的丰度。对于一个插入片段平均为 20kb 的基因组文库来说，要有大于 10⁵ 的复杂度，以确保目的基因至少出现一次。对一个高复杂度的典型文库来说，用 10^4~10⁶ 个噬菌体做模板，可以显示基因在库中的丰度。加入的含有一个或两个目的基因拷贝的噬菌体的数目，应该用作文库筛选。

一旦确定了 PCR 条件和基因的丰度，就可以按照如下方法进行文库筛选。

1. 取 0.5 ml 新鲜的、在 LB 中过夜培养的细菌培养物，与 0.5 mlSM 混合，加入含有文库的噬菌体，室温温育 20 min。

2. 加入 20 ml 含 10 mmol/LMgSO₄ 的 LB，按 8X8 矩阵分装到 96 孔板中，每孔 100ul。将板用聚酯封口膜密封，37°C 225r/min 振荡培养 5~6 h, 对噬菌体进行扩增。扩增之后，噬菌体的浓度应该增加到大概 10⁹ 个/ml。大概有 1/3 的培养物能被均分进 96 孔板，在计算步骤 1 的加入噬菌体数时应当考虑到这一点。

3. 将一排或一列 8 个孔中的噬菌体（每孔 25ul) 用多孔移液器混合（参看讨论部分的可变样式）。在这一步中，当取掉封口膜和移液时，一定要特别小心，以避免样品交叉污染。如果想避免交叉污染，可以将板子短暂离心，以帮助清除封口膜上的液体。用聚酯封口膜将板子重新封闭，在 4°C 可以保存 1 个月。

4. 用蒸馏水按 1:1 稀释噬菌体，现在噬菌体就可以用作 PCR 模板了。

5. 在 24.5ul PCR 主要混合物中加入 0.5ul 的模板（噬菌体），用上面建立的 PCR 条件进行 PCR。每个实验需要有一个负对照（不加模板）和一个正对照（即能产生阳性信号的10ng 的总基因组 DNA 或一小份的起始文库）。

6. 通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。用溴化乙锭染胶并拍照（Sambrook and Russell2001)。

7.70°C 其空干燥凝胶，变性 DNA, 然后将寡核苷酸探针（末端用 32P 标记）用标准的DNA 杂交条件与干燥的凝胶直接进行杂交，洗涤，然后放射性自显影 [这一步的技术细节可以参看 Israel(1993)]。用溴化乙锭染色很容易就能看到特异的 PCR 产物时，这一步是可以选做的，下面会有讨论。也可以用标准技术将 DNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后再进行杂交。

笫 6 步和/或第 7 步東得的数据应该能鉴定出含有目的基因的亚库（见讨论部分笫一轮的筛选现在就完成了，与起始文库相比阳性亚库中的基因已经被富集了，后续的筛选循环是 1~7 步的重复，在扩增的亚库噬菌体定量之后就可以进行。

8. 通过噬菌斑法确定阳性孔中的噬菌体的量（Sambrook and Russell2001)。

9. 用约为上一轮数量 1/30 的噬菌体侵染细菌，开始下一轮的筛选。

10. 重复 2~9 步。