| 实验步骤 |
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
氯仿-异戊醇（24:1)
酚：氯仿-异戊醇（25:24:1)
氯化锂 (LiCl,10mol/L)
酚（Tris-饱和），pH8.0
TE 缓冲液（5 mmol/LTris-HCl、pH8.0，0.1mmol/LEDTA)
乙醇,100%
2. 酶和酶缓冲液
碱性磷酸酶（0.1~0.2U)(用于方法 B)
商业上的分子生物学级别的碱性磷酸酶通常含有核酸酶的污染。推荐使用细菌碱性磷酸酶，它已经过纯化除去了污染的核酸酶，并且在 PCR-Script 检測中有重要的质量控制的作用。
平末端限制性内切酶（10~20U)
和反应缓冲液，即 SrfⅠ或 SmaⅠ通用缓冲液，10X(用于方法 B, 需要与使用的限制酶和碱性磷酸酶一致）（1mol/L 乙酸钾，250
mmol/LTris-乙酸盐、pH7.6，100 mmol/L 乙酸镁，5 mmol/L/β-巯基乙醇,100ug/mlBSA)
3. 核酸和寡核苷酸
克隆载体（1ug)
4. 专用设备
3 个水浴锅，在限制酶和碱性磷酸酶处理前（方法 B) 把水浴调到相应适当的温度，另外一个调成 65°C
真空干燥机
5. 额外项目
可选择：琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭
二、方法 A—准备双向克隆载体.
平末端克隆程序应用含有平末端的克隆载体去捕获
DNA 片段来进行双向插入。因此，平末端载体不需要核苷酸突出端用来克隆插入片段。随后，平末端 DNA 片段，比如 PCR
产物，可以直接克隆进这些载体。平末端克隆本质上是一个效率很低的方法，一般重组插入占整体转化子不到 10%[见图
28-2(a)]。通过向连接反应体系中加入一个限制酶来提高效率，正如 PCR-Script 方法 [见图 28-2(b)](Liuand
Schwartz1992)。
1. 在如下 20ul 反应混合物中，用适当的平末端限制性内切酶消化 1pg 载体 DNA。
载体 DNA(lug/ul) 1ul
限制酶（10U/ul) 1ul
反应缓冲液，10X 2ul
H20 补充到 2ul
2. 在适当的温度下温浴消化1h。
可以选做：取 1ul 消化产物进行琼脂糖凝胶电泳检测载体 DNA 线性化程度.
3. 用酚/氯仿抽提消化产物，然后加入等体积的 Tris 饱和酚（pH8.0)，剧烈振荡，将上层液相转移到一个新管中。向试管中加入等体积的氯仿，振荡。简短离心，小心地将上层液相转移到一个新管。
4.65°C 热处理抽提出来的 DNA20 min, 除去残留的氯仿（氯仿的沸点是 55°C)。
5. 向第 2 步中的 DNA 抽提物中加入 0.1 倍体积的 10mol/L LiCl 和 2.5 倍体积冰预冷的 100% 乙醇，用来沉淀 DNA。轻轻地混匀，在室温下 12000 g 离心 10 min。
6. 离心后，小心倒出上清液。在真空下抽干 DNA 沉淀 10min。
7. 用 5ulTE 缓冲液重溶 DNA, 将已经预先消化好的双向克隆载体置于-20°C 保存。
当用 50ulTE 缓冲液重溶 DNA 时，消化好的 DNA 最终浓度应该大约是 10ng/ul。
三、方法 B-------定向克隆载体
人们根据已知的
T4DNA 连接酶和大肠杆菌转化的特性，开发出定向克隆的方法，这个方法不需要向引物中加入额外的碱基。首先，T4DNA 连接酶同时需要
5'端磷酸和 3'端羟基基团来有效地连接 DNA 的两条链。其次，线性 DNA 转化 rcBC 缺陷的大肠埃希菌寄主效率非常低（大约降低了 4
个数量级）。因此，理论上来说通过制备一个单磷酸化载体和一个单磷酸化的插入片段就可以实现定向克隆。插入片段按期望的方向连入载体则会产生一个单切刻环状分子；如果在非期望的反方向插入，则连接反应将产生一个线性分子，它转化大肠杆菌的效率非常低。用一种限制性内切酶处理载体，再用碱性磷酸酶除去暴露在外的
5‘磷酸，随后用另一种限制性内切酶消化载体，如此便产生了一个单磷酸化的载体。简并性限制性内切酶也可以用于这种方法。
正确的
DNA 序列操作使得酶处理过的载体能够在 PCR-Script
类反应中使用，因为自连载体容易被连接反应体系中的内切酶消化，而且报告基因的阅读框架是保守的。因为载体自连后会产生一个限制酶位点，不可高估使用一个高度纯化的酶来进行定向和双向克隆操作的必要性。必须检测核酸酶的污染并且在进行上述实验以前将核酸酶的污染除去干净。一个特别的例子，应用
PCR-Script Direct 定向克隆方法，酶切处理了一个 SK(+) 多克隆位点，使得它同时含有一个 Srf
Ⅰ(5'-GCCC|GGGC-3') 位点和一个 SmaI(5'-TCCC 丨 GGGC-3', 下划线表示 Sam
Ⅰ目标序列）位点（Weiner1993)。载体首先用 Srf Ⅰ消化，然后用一个碱性磷酸酶除去磷酸，再用 SmaI 进行第二次消化。除去 Srf
Ⅰ-Sam Ⅰ消化后产生的短 DNA 片段。Srf Ⅰ位点仍然得到保留（见图
28-3)。因为阅读框是保守的，仍然能够使用表型选择。单磷酸化载体可以按下述的通用指南制备。
1. 按如下体系，用第一个平末端限制性内切酶（Srf Ⅰ) 消化适当的载体 DNA。
载体 DNA(1ug/ul) 1ul(原文为 1ug/ul。—编者改）
限制酶（10U/ul) 1~2ul
通用缓冲液*，l0X 2ul
H20 补充到 50ul
2. 在适当的温度下温浴 1h。
可选做：取 1ul 消化产物进行琼脂糖凝胶电泳检测载体 DNA 线性化程度。
*使用能够同时应用于第一个限制性内切酶消化及碱性磷醭酶去磷酸化反应的缓冲液优化载体 DNA 的酶处理过程。
3.65°C 温浴 20 min 使限制酶失活，然后置于冰上。
4. 直接向热处理过的混合物中加入碱性磷酸酶（0.1~0.2U)，再按操作指南所述溫浴。
5.
用酚/氯仿抽提已经被限制酶消化且被碱性磷酸酶处理过的质粒 DNA。然后加入等体积的 Tris
饱和酚，剧烈振荡，将上层液相转移到一个新管。向试管中加入等体积的氯仿，振荡。将上层液相转移到一个新管。65°C 热处理抽提出来的 DNA20
min, 除去残留的氯仿。
6. 建立第二个 30ul 的限制酶消化体系，它含有已被碱性磷酸酶处理过的载体 DNA 和下游的平末端限制性内切酶，即加入 15ul 已经用酚/氯仿抽提过的 DNA、H20、1X 通用缓冲液和酶（10~20U)。在推荐的温度下温浴消化 lh。
7.65°C 温浴 20 min 使第二个限制酶失活，然后置于冰上。
8. 加入 0.1 倍体积的 10mol/LLiCl 和 2.5 倍体积冰预冷过的 100% 乙醇，以沉淀单磷酸化 DNA。轻轻地混勻，在室温下 12000 g 离心 10min。
9. 离心后，小心倒出上清液。在真空下抽干 DNA 沉淀 10min。
10. 用 25ulTE 缓冲液重溶 DNA。
当用 25ulTE 缓冲液重溶 DNA 时，单磷酸化的 DNA 最终浓度应该大约是 10ng/ul。将已经单磷酸化的定向克隆载体置于-20°C 保存备用。
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